小GTP酶Rac1对气道上皮细胞凋亡和吞噬作用的影响

发布时间：2018-05-24 17:49

  本文选题：气道上皮细胞系A549 + Rac1　； 参考：《江苏大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:哮喘时大量上皮细胞发生凋亡且难以清除可能是构成气道高反应性的潜在因素。本论文以气道上皮细胞系A549为研究对象,分析Rac1的表达与细胞凋亡的关系和对凋亡细胞吞噬功能的影响,借此探讨哮喘患者气道高压形成的因素和可能机制,也为控制哮喘寻找新的、可能的干预靶点。方法:1.A549细胞的培养:将气道上皮细胞系A549用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养,待细胞生长状态良好时用于相关试验。细胞冻存则按常规方法进行。2.选择姜黄素为凋亡诱导物,诱导气道上皮细胞A549的凋亡。分别以30μmol/L、50μmol/L、70μmol/L浓度的姜黄素刺激细胞12小时、24小时和48小时,分析上述条件下A549的凋亡情况。3.流式细胞术检测细胞凋亡:采用AnnexinV和PI双染的方法,依照试剂盒使用说明书,染色凋亡的A549细胞,并于4小时内进行流式细胞的检测分析,观察细胞的凋亡情况。4.Hoechst核染色观察凋亡细胞的形态:Hoechst核染液在细胞凋亡后依照具体标准操作流程染凋亡细胞,在荧光显微镜下观察凋亡细胞的细胞形态和核形态,以直观A549细胞的凋亡情况。5.A549细胞吞噬试验:选取状态良好的A549细胞,以每孔4x105个细胞接种于六孔细胞培养板,5%CO2、37℃恒温培养箱中过夜。待细胞生长密度至50%-60%时,收集已诱导48小时的凋亡细胞。重悬后PI染色5min,PBS洗两遍。将处理后的凋亡细胞以2倍于正常细胞的量加入六孔培养板中,37℃恒温共培养90min后进行流式分析和荧光定量PCR的检测。6实时荧光定量PCR(qRT-PCR):在进行A549细胞的吞噬试验后,用实时荧光定量PCR法测定IL-33和Rac1的mRNA表达水平。7.Rac1抑制剂(NSC23766)抑制吞噬试验:在吞噬试验进行的24小时前,将Rac1抑制剂NSC23766依照50μmol/L,100μmol/L的浓度分别加入培养体系。24小时后弃上清换全新培养液,继续依照吞噬实验步骤进行吞噬试验。结果：1.姜黄素可以诱导A549细胞发生凋亡:将姜黄素以50μmol/L的浓度刺激A549细胞24小时,约有五成的细胞发生凋亡,其中20%左右为晚凋;而当时间条件为48小时时,90%的细胞发生了凋亡。2.Rac1抑制剂(NSC23766)可以增强姜黄素引起的凋亡效应:在姜黄素的凋亡诱导实验中加入Rac1抑制剂,可以使A549的凋亡效应显著增强,并且随着抑制剂浓度的增加,这种增强的效应更加明显,呈剂量依赖性。3.气道上皮细胞A549具有吞噬能力:吞噬试验后的流式检测结果显示,生长状态良好的未经凋亡诱导的A549细胞能够吞噬凋亡细胞,表明A549细胞具有良好的吞噬能力。4.吞噬过程中IL-33表达水平增高:吞噬试验后将参与吞噬作用的A549细胞进行荧光定量PCR分析。结果发现,IL-33的mRNA水平明显增高,但Rac1的表达水平没有变化。5.Rac1抑制剂(NSC23766)可以抑制A549细胞的吞噬功能:吞噬试验中加入抑制剂后能够发现,A549细胞的吞噬能力下降。结论:姜黄素能够有效地诱导A549细胞的凋亡。Rac1抑制剂的作用表明在凋亡过程中,Rac1的表达对上皮细胞凋亡起着负向调节作用,而对上皮细胞的吞噬功能则有明显的促进效应。
[Abstract]:Objective : To investigate the apoptosis of A549 cells . The apoptosis of A549 cells was investigated by means of real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) .
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R562.25

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本文编号：1929986