精氨酸血管加压素通过钙离子依赖性蛋白激酶C信号传导途径增强T型钙电流

发布时间：2018-05-25 00:00

  本文选题：精氨酸血管加压素 + T型钙电流　； 参考：《河北医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:精氨酸血管加压素(arginine vasopressin,AVP),是一种九肽神经垂体激素,由下丘脑的视上核和室旁核分泌,目前已经作为血管收缩剂用于心脏骤停急救及严重创伤休克后血管低反应性的恢复中,由于AVP V2受体拮抗剂具有高选择性,排水不排钠,能够增加自由水的排除而对电解质没有明显影响,因此其已应用于心衰引起的低钠血症治疗中,另外AVP可以诱导V1a受体促进心肌成纤维细胞转化为分泌更强的肌成纤维细胞,引起心肌纤维化,多种研究证实了AVP可以调节L型离子通道,KCNQ钾通道等导致心律失常作用。本实验室既往研究已证明在急性和慢性作用时,AVP均可增加T型钙电流,但是关于AVP对T型钙通道作用机制尚未完全阐明。本研究使用全细胞膜片钳技术从钙敏感性调节分子PKC途径入手研究其机制。主要内容包括三部分:(1)进一步明确AVP对T型钙电流的作用;(2)AVP调节T型钙电流的作用与细胞内钙离子浓度的关系;(3)AVP通过钙离子依赖性PKC信号传导途径增强T型钙电流。方法:1制备和培养新生SD大鼠心室肌细胞实验中使用1-3天内的新生SD大鼠制备原代新生乳鼠心肌细胞,经酶解法分离,将心肌细胞接种于35mm含10%牛血清的培养液的细胞培养皿中并置于37℃含5%CO2/95%O2培养箱中培养。约12-24小时间后进行细胞电生理记录。2全细胞模式电流记录L型钙离子电流和T型钙电流使用全细胞模式记录,室温条件为(20℃-23℃),电极外液(mmol/L):氯化四乙铵(TEA)-Cl 136,Ca Cl22,Mg Cl2 2,HEPES 25,葡萄糖20,TEA-OH调节p H为7.3。根据Fabiato方程式电极内液(mmol/L)设置为五种不同的钙离子浓度:Cs Cl 130,Mg-ATP 2,HEPES 25,Cs-OH调节p H为7.3(钙离子浓度如表1溶液A,B,C,D,和F)。玻璃微电极注入电极内液后阻抗达4-6MΩ。L型+T型钙电流的测定设计为:维持电位为-100m V,测试电位为-90m V至+50m V,阶跃电压10m V,步宽300ms。L型钙电流的测定设计为:维持电位为-50m V,测试电位为-40m V至+50m V,阶跃电压10m V,步宽300ms。本研究采用同一细胞药物刺激前后自身对照的方法,记录300n M AVP对SD大鼠心肌细胞T型钙通道的影响:(1)使用不同钙离子浓度的电极内液(p Ca=7 p Ca=8 p Ca=9 p Ca=10 p Ca=11)记录未加入AVP时的钙电流作为正常对照组,随后加入300n M AVP,5分钟后在次记录钙电流记录作为实验组。(2)本研究为进一步探讨AVP对ICa.T的作用机制,使用蛋白激酶抑制剂(蛋白激酶A,PKA抑制剂、PKC抑制剂、蛋白激酶G,PKG抑制剂、钙调蛋白II,Ca Mk II抑制剂、细胞外相关信号传导激酶抑制剂)对细胞培养1小时后,在含有生理状态的钙离子浓度p Ca=7.2细胞外液中,记录AVP作用前后T型钙通道电流的变化。3数据处理及统计方法数据经膜片钳放大器(HEKA EPC 10,德国)采集,数据用mean±SE表示,相同钙离子浓度实验组采用t检验进行分析加药前后两组,不同钙离子浓度实验组使用多因素试验资料的方差分析,P0.05认为有统计学意义。结果:1 AVP能够增加T型钙电流这一作用受细胞内钙离子浓度调节。当p Ca=11时,300n M AVP实验组和正常对照组相比。T型钙电流增加幅度为(9.63±0.83)%(n=12,P0.05~0.01);当p Ca=10时,300n M AVP实验组和正常对照组相比,T型钙电流增加幅度为(27.83±2.43)%(n=12,P0.01);当p Ca=9时,300n M AVP实验组和正常对照组相比,T型钙电流增加幅度为(33.28±4.90)%(n=13,P=0.001);当p Ca=8时,300n M AVP实验组和正常对照组相比,T型钙电流增加幅度为(37.30±3.36)%(n=10,P0.05);当p Ca=7时,300n M AVP实验组和正常对照组相比,T型钙电流增加幅度为(39.75±4.41)%(n=12,P0.05~0.01)。由此可见当细胞内液钙离子浓度为p Ca7时,T型钙通道电流明显增加,而当细胞内液钙离子浓度为p Ca11时,T型钙电流增加不明显,当对p Ca=7时和p Ca=11时AVP对T型钙电流增加幅度进行统计学分析P=0.001这些数据表明随着细胞内钙离子浓度的增加AVP对心肌细胞T型钙电流增强作用更加明显。AVP对T型钙电流调控作用依赖细胞内液钙离子浓度的变化。2 AVP可能通过钙依赖性PKC信号传导途径增强T型钙电流。为进一步探讨AVP对ICa.T的作用机制,使用蛋白激酶抑制剂对细胞培养1小时后,在含有生理状态的钙离子浓度p Ca=7.2细胞外液中,记录AVP作用前后T型钙通道电流的变化。对照组为300n M AVP,p Ca=7.2,ICa.T增加38.67±8.74%;加入H-89(蛋白激酶A,PKA抑制剂10κmol/L),AVP作用下ICa.T增加36.06±7.18%;加入白屈菜赤碱(PKC抑制剂5κmol/L)AVP作用下ICa.T增加14.68±5.21%。加入KT5823(蛋白激酶G,PKG抑制剂1κmol/L),AVP作用下ICa.T增加37.87±6.36%。加入KN-62(钙调蛋白II,Ca MKII抑制剂3κmol/L),AVP作用下ICa.T增加39.9±7.26%,加入PD 98059(细胞外相关信号传导激酶抑制剂10κmol/L),AVP作用下ICa.T增加37.60±5.36%。分别用各抑制剂实验组增长率与对照组比较,其中PKC抑制剂组P0.05。其他实验组P值均大于0.05,此结果说明加入PKC抑制剂AVP对T型钙电流的作用减弱具有统计学意义,即AVP可能通过V1a介导PKC信号传导途径增强T型钙电流。结论:AVP通过激活钙依赖性PKC信号传导途径增强T型钙电流。
[Abstract]:AIM : To study the effect of AVP on calcium current in rats with acute and chronic effects . 130,Mg-A In this study , the effect of 300n M AVP on T - type calcium channel in myocardial cells of SD rats was studied by using the method of self - control before and after stimulation with the same cell drug : ( 1 ) The calcium current was recorded as normal control group with different calcium ion concentrations ( p Ca = 7 p Ca = 8 p Ca = 9 p Ca = 10 p Ca = 11 ) . Then 300n M AVP was added and the calcium current was recorded as experimental group after 5 minutes . ( 2 ) To investigate the effect of AVP on ICa . T , the changes of T - type calcium channel current before and after AVP were recorded by using protein kinase inhibitor ( protein kinase A , inhibitor of protein kinase , PKC inhibitor , protein kinase G , PKGs inhibitor , calcium tone protein II , Ca 2 inhibitor , extracellular signal transduction kinase inhibitor ) . The results showed that the increase of T - type calcium current was ( 33.28 卤 4.90 ) % ( n = 12 , P = 0.001 ) . Compared with the control group , the increase of T - type calcium current was ( 39.75 卤 4.41 ) % ( n = 12 , P 0.05 锝，

本文编号：1931146