四妙勇安汤配伍规律研究

发布时间：2018-08-07 15:08

【摘要】：本论文分为五个部分第一部分:文献综述对中药复方配伍的研究思路、研究方法及其实际应用进行了综述,并对中药复方配伍规律研究进行展望;总结了四妙勇安汤及其组方药味金银花、玄参、当归、甘草的化学成分(部分挥发性成分),共633个化合物。共引用文献188篇。第二部分:四妙勇安汤入血成分研究采用LCMS-IT-TOF法鉴定了四妙勇安汤中14个入血成分,其中9个为原型成分,5个可能是四妙勇安汤在体内的代谢成分。通过对比四妙勇安汤复方与组方药味含药血清总离子流色谱图,发现所鉴定的复方入血成分中化合物2、马钱苷(4)、当药苷(5)、金丝桃苷(7)和异绿原酸C(11)来自于方中君药金银花,哈巴苷(1)、安格洛苷C(10)和哈巴俄苷(13)来自于方中臣药玄参,甘草素硫酸和葡萄糖醛酸酯结合物(8)、甘草素-7-O-硫酸-4'-O-葡萄糖醛酸酯(12)、甘草素-4'-O-葡萄糖醛酸酯或其异构体(14)和甘草苷(6)来自于方中使药甘草,绿原酸(3)来自于君药金银花和佐药当归两个组方药味,化合物9未发现存在于任一组方药味中。通过对比四妙勇安汤复方及其组方药味体外供试品溶液与四妙勇安汤含药血清总离子流色谱图,确认哈巴苷(1)、绿原酸(3)、马钱苷(4)、当药苷(5)、甘草苷(6)、金丝桃苷(7)、安格洛苷C(10)、异绿原酸C(11)和哈巴俄苷(13)为原型入血成分。通过对比四妙勇安汤复方含药血清与组方药味含药血清总离子流色谱图,确认化合物2、甘草素硫酸和葡萄糖醛酸酯结合物(8)、化合物9、甘草素-7-O-硫酸-4'-O-葡萄糖醛酸酯(12)和甘草素-4'-O-葡萄糖醛酸酯或其异构体(14)为代谢入血成分。在后续研究中,可进一步考察这些入血成分的生物活性,将有助于更好地阐明四妙勇安汤的体内药效物质,并可为四妙勇安汤复方及其组方单味药质量控制标准的建立提供参考。第三部分:基于血清原型成分的复方煎煮配伍研究采用UPLC-MSn法建立了四妙勇安汤水煎液中9种入血成分(哈巴苷、绿原酸、当药苷、马钱苷、甘草苷、金丝桃苷、异绿原酸C、安格洛苷C、哈巴俄苷)的含量测定方法。采用负离子检测模式,分别以哈巴苷(m/z 183.06)、绿原酸(m/z 191.04)、当药苷(m/z 125.00)、马钱苷(m/z227.03)、甘草苷(m/z 135.02)、金丝桃苷(m/z300.07)、异绿原酸C(m/z353.11)、安格洛苷C(m/z175.05)、哈巴俄苷(m/z345.13)为定量离子,其回归方程分别为:Y= 13.6102 X+ 1555.7450(r = 0.9995)、Y = 85.9195 X +74658.0895(r = 0.9994)、Y= 6.7546X+401.3286(r = 0.9998)、Y= 27.4063X+89.7270(r = 0.9990)、Y= 570.4144X+4628.2593(r= 1.0000)、Y=356.9293X-825.7706(r =0.9996)、Y=93.8354X+7178.6005(r= 0.9993)、Y=218.7902X+4923.2821(r = 0.9992)、Y= 135.1618X-130.4727(r= 1.0000),各成分分别在 139.156～10095.587、683.126～24962.377、56.881～4126.646、10.019～726.861、54.441～3949.616、4.190～304.014、115.297～8364.659、37.065～1354.404、10.816～784.711 μg·g-1 范围内呈良好线性关系,其含量分别为 0.1977%、0.8555%、0.1317%、0.0355%、0.1496%、0.0035%、0.1655%、0.0524%、0.0440%(n = 6),平均回收率在 84.125%～113.376%之间,RSD 在 2.211%～10.265%之间,且方法精密度、稳定性和重复性良好。测定了四妙勇安汤及其不同拆方组合中上述9种入血成分的提取率。发现两药配伍均能提高金银花中绿原酸的提取率(8.53%～12.00%),三药配伍均降低绿原酸的提取率(8.99%～13.74%),而复方中绿原酸的提取率较单味药和两药配伍时明显降低(8.97%～12.44%),较三药配伍时有所提高(8.55%～13.30%)。两药配伍和三药配伍均降低了金银花中异绿原酸C的提取率(2.09%～66.48%),复方中异绿原酸C的提取率较单味药和任意配伍时都有所提高(22.75%～87.14%)。配伍当归后提高了金银花中当药苷的提取率(1.27%),其他配伍组合均降低了当药苷的提取率(10.24%～37.76%)。不同配伍组合均降低了金银花中马钱苷的提取率(41.30%～90.78%),金银花配伍当归或甘草均明显提高金丝桃苷的提取率(9.68%、13.38%),金银花、当归和甘草三药配伍后,金丝桃苷的提取率较单味药有所提高(2.44%)。复方中金丝桃苷的提取率明显低于任意配伍组合后金丝桃苷的提取率(2.62%～18.59%)。不同配伍组合均可降低玄参中哈巴苷的提取率(9.82%～99.78%),复方中哈巴苷的提取率最低(49.40%)。不同配伍组合均可降低玄参中安格洛苷C的提取率(22.76%～42.87%),三药配伍组合对于安格洛苷C提取率的降低作用明显高于两药配伍组合对于安格洛苷C提取率的降低作用。不同配伍组合均可降低玄参中哈巴俄苷的提取率(7.46%～83.74%),两药配伍组合对于哈巴俄苷提取率的降低作用明显高于三药配伍组合对于哈巴俄苷提取率的降低作用。不同配伍组合均可降低甘草中甘草苷的提取率(51.02%～93.03%),其中甘草配伍金银花和玄参后甘草苷的提取率最低,三药配伍组合对甘草苷提取率的抑制作用稍高于两药配伍组合对甘草苷的抑制作用。第四部分:基于血清原型成分在体肠吸收的配伍研究采用UPLC-MSn法建立了四妙勇安汤水煎液中9种入血成分(哈巴苷、绿原酸、当药苷、马钱苷、甘草苷、金丝桃苷、异绿原酸C、安格洛苷C、哈巴俄苷)的在体肠吸收含量测定方法。采用负离子检测模式,分别以哈巴苷(m/z 183.11)、绿原酸(m/z 191.05)、当药苷(m/z 125.07)、马钱苷(m/z227.12)、甘草苷(m/z255.13)、金丝桃苷(m/z 300.20)、异绿原酸 C(m/z 353.18)、安格洛苷 C(m/z 175.05)、哈巴俄苷(m/z 147.03)为定量离子,各成分回归方程分别为:Y= 13.4291 X+ 1855.7552(r= 0.9993)、Y=91.4800 X+ 50080.5633(r = 0.9992)、Y= 6.9746 X+ 180.1241(r = 0.9999)、Y= 30.1934 X-184.5150(r = 0.9995)、Y=568.2259X+5623.1312(r= 1.0000)、Y=351.2752X-489.7681(r = 0.9998)、Y=94.0494X+8443.4213(r=0.9996)、Y=220.0985X+5120.6526(r =0.9991)、Y= 134.0560X+36.0185(r= 1.0000),分别在 138.857～10073.892、681.647～24908.336、56.758～4117.722、9.954～722.159、54.375～3944.814、4.181～303.358、115.047～8346.553、36.985～1351.469、10.793～783.013 μg·g-1 范围内呈良好线性关系,低剂量含量分别为 0.2162%、0.9211%、0.1357%、0.0261%、0.1550%、0.0036%、0.1504%、0.0518%、0.0456%(n = 6);中剂量含量分别为 0.1971%、0.8676%、0.1285%、0.0228%、0.1497%、0.0036%、0.1756%、0.0582%、0.0444%(n = 6);高剂量含量分别为 0.1968%、0.8895%、0.1318%、0.0223%、0.1485%、0.0036%、0.1883%、0.0596%、0.0441%(n =6),低剂量回收率在83.834%～112.324%之间,RSD在4.850%～14.141%之间;中剂量回收率在84.524%～117.079%之间,RSD在1.639%～13.814%之间;高剂量回收率在85.176%～119.501%之间,RSD在2.102%～7.149%之间,且方法精密度、稳定性和重复性良好。比较了 9种入血成分在十二指肠、空肠、回肠、结肠药物吸收速率常数(Ka)和药物表观吸收系数(Papp)的差异,确定了十二指肠和回肠两个考察肠段。十二指肠:复方中绿原酸的肠吸收参数高于单味金银花和任一配伍组合。当归与金银花为伍的任一配伍组合都会提高绿原酸在十二指肠段的吸收,但甘草与金银花配伍后会影响绿原酸在十二指肠段的吸收。不同配伍组合当药苷与马钱苷的肠吸收参数Ka、Papp值在复方和单味金银花中较高,但其统计学结果并不具有显著性差异。不同配伍组合金丝桃苷的肠吸收参数Ka、Papp值在金银花与甘草配伍组合时最高,其统计学结果具有显著性差异(P0.01)。异绿原酸C在单味金银花和复方中肠吸收参数较高,其统计学结果具有显著性差异(P0.05),在金银花、玄参、甘草三药配伍时肠吸收情况最好,其统计学结果具有显著性差异(P0.01)。复方和金银花、玄参、甘草三药配伍组合哈巴苷的肠吸收参数Ka、Papp值明显高于单味药和其他配伍组合哈巴苷的肠吸收参数值,统计学结果具有显著性差异(P0.01)。不同配伍组合安格洛苷C的肠吸收参数均明显高于单味玄参中安格洛苷C的肠吸收参数,且统计学结果具有显著性差异(P0.05)。其中复方中安格洛苷C的肠吸收参数值最高,但复方与其他配伍组合相比较并不具有显著性差异。不同配伍组合哈巴俄苷的肠吸收参数Ka、Papp值以复方最高,单味玄参最低,但其两两比较并不具有显著性差异。甘草与当归配伍后甘草苷的肠吸收情况最好,其统计学结果具有显著性差异(P0.05)。回肠:复方中绿原酸的肠吸收参数高于单味金银花和任一配伍组合。当归与金银花为伍的任一配伍组合都会提高绿原酸在回肠段的吸收,但甘草与金银花配伍后会影响绿原酸在回肠段的吸收。不同配伍组合当药苷与马钱苷的肠吸收参数Ka、Papp值在复方和单味金银花中都处于较低水平。不同配伍组合金丝桃苷的肠吸收参数Ka、Papp值在金银花与甘草配伍组合后都有所降低,金银花、玄参、当归三药配伍时金丝桃苷的吸收处于最高水平。复方中金丝桃苷的吸收参数值未见高于所有拆方配伍组合。异绿原酸C在复方中肠吸收参数最高,但其统计学结果不具有显著性差异。玄参中三个指标成分哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷的肠吸收参数均在金银花、玄参、当归三药配伍时最高,在单味玄参中呈现较高的肠吸收水平,但在复方中三个指标成分的肠吸收参数值都较低,其中安格洛苷C与哈巴俄苷在复方中肠吸收参数值最低。单味甘草中甘草苷的回肠吸收参数最高,复方中甘草苷的吸收处于不同配伍的中等水平。第五部分:基于血清原型成分药代动力学的配伍研究采用UPLC-MSn法建立了四妙勇安汤水煎液中7种入血成分(哈巴苷、绿原酸、当药苷、马钱苷、甘草苷、安格洛苷C、哈巴俄苷)的血浆样品含量测定方法。采用负离子检测模式,以蒙花昔为内标,分别以哈巴苷(m/z 183.11)、绿原酸(m/z 191.05)、当药苷(m/z 125.07)、马钱苷(m/z 227.12)、甘草苷(m/z 255.13)、安格洛苷 C(m/z 175.05)、哈巴俄苷(m/z 147.03)、蒙花苷(m/z 283.15)为定量离子,各成分分别在0.667～1558.660、0.807～1886.321、5.813～13580.340、1.690～3948.969、0.161～1003.754、0.121～2157.445、0.029～580.335 μg·mL-1线性范围内呈良好线性关系,低剂量基质效应在80.590%～111.896%之间,RSD在2.420%～9.730%之间;中剂量基质效应在81.085%～113.569%之间,RSD在1.155%～5.733%之间;高剂量基质效应在82.892%～105.884%之间,RSD在1.355%～10.577%之间,低剂量提取回收率在84.869%～97.436%之间,RSD在1.044%～13.620%之间;中剂量提取回收率在82.900%～99.485%之间,RSD在3.017%～6.776%之间;高剂量提取回收率在86.785%～98.187%之间,RSD在0.810%～8.572%之间,方法精密度、准确度良好,方法稳定性、短期稳定性、长期稳定性、冻融稳定性良好,符合生物样品检测分析要求。采用所建立的血浆样品含量测定方法测定了不同拆方组合大鼠灌胃给药后目标成分的药代动力学差异。哈巴苷:复方中哈巴苷的达峰时间(Tmax)明显延长(P0.01),且三药配伍组合后哈巴苷的达峰时间(Tmax)均高于两药配伍组合后的达峰时间(Tmax)(p0.05)。其药时曲线下面积AUC在单味玄参中最高,在复方与其他配伍组合中未见明显差异。复方中哈巴苷的平均驻留时间(MRT)值仅低于玄参与甘草配伍组合,在其他配伍组合中处于较高水平(P0.05)。不同配伍组合后哈巴苷的半衰期(t1/2)未见明显差异,其药峰浓度(Cmax)在单味玄参和复方中都处于较高水平,高于除金银花、玄参、当归三药配伍的任一配伍组合(P0.05),且三药配伍组合的药峰浓度值(Cmax)均高于两药配伍组合。绿原酸:复方中绿原酸的半衰期(t1/2)和其他配伍组合相比明显延长(P0.01)。其药时曲线下面积(AUC)在单味金银花中呈现最高值(P0.01),其他配伍组合中此参数水平未见明显差异。其平均驻留时间(MRT)值在金银花与玄参配伍后最高,其他配伍组合中此参数未见明显差异。复方配伍后绿原酸的达峰时间(Tmax)有所延长,其参数值高于除金银花、当归、甘草配伍之外的任一配伍组合(P0.05)。绿原酸的药峰浓度(Cmax)在单味金银花中处于最高水平(P0.05),复方中此参数值高于除金银花、玄参配伍之外的任一配伍组合(P0.05)。当药苷:当药苷在复方中的平均驻留时间(MRT)和达峰浓度(Tmax)都明显高于单味金银花和其他配伍组合,但其统计学结果并不具有显著性差异。其在不同配伍组合中的半衰期(t1/2)变化较为明显,单味金银花和复方中当药苷的半衰期(t1/2)较其他配伍组合显著缩短(P0.05),且复方中此参数值最小。马钱苷:复方中马钱苷的药时曲线下面积(AUC)明显高于其他配伍组合(P0.05),其平均驻留时间(MRT)明显高于其他配伍组合(P0.01),其达峰浓度(Tmax)值有所提高,但其统计学结果并不具有显著性差异。马钱苷在单味金银花与复方中的其半衰期(t1/2)和药峰浓度(Cmax)都较其他配伍组合有所缩短(P0.01)和降低(P0.05)。甘草苷:复方中甘草苷的半衰期(t1/2)较其他配伍组合明显延长(P0.01),其他配伍组合之间此参数值未见明显差异。不同配伍组合中甘草苷的平均驻留时间(MRT)均较单味甘草明显提高(P0.05),复方中甘草苷的平均驻留时间(MRT)值最高,但与其他配伍组合相比较未见统计学差异。甘草苷的达峰时间(Tmax)和药峰浓度(Cmax)在复方中都有所降低。安格洛苷C:复方中安格洛苷C的平均驻留时间(MRT)最长,但其统计学结果并不具显著性差异。复方中安格洛苷C的药时曲线下面积(AUC)较三药配伍组合明显提高(P0.05)。不同配伍组合后安格洛苷C的半衰期(t1/2)都较单味玄参显著延长(P0.05),但复方中此参数值亦处于较低水平。安格洛苷C的达峰时间(Tmax)在不同配伍组合中未见明显差异,但复方中其药峰浓度(Cmax)较其他配伍组合明显提高(P0.05)。哈巴俄苷:不同配伍组合中哈巴俄苷的半衰期(t1/2)变化明显,复方中其半衰期(t1/2)值最高,统计学差异显著(P0.01),且三药配伍组合后此参数值均显著高于两药配伍组合(P0.05)。复方中哈巴俄苷的药峰浓度(Cmax)明显高于其他配伍组合(P0.05),而复方中其达峰时间(Tmax)变化并不明显。复方中哈巴俄苷的药时曲线下面积(AUC)较除单味玄参以外其他配伍组合明显提高(P0.01)。创新性首次采用LCMS-IT-TOF法鉴定和归属四妙勇安汤及其组方药味入血成分;首次采用UPLC-MSn法进行基于血清原型成分的四妙勇安汤煎煮配伍研究;首次采用UPLC-MSn法进行基于血清原型成分在体肠吸收的四妙勇安汤配伍研究;首次采用UPLC-MSn法进行基于血清原型成分药代动力学的四妙勇安汤配伍研究。
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【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R289.5

【参考文献】