正丁基苯酞对实验性脑缺血小鼠脑梗死后血管新生的研究

发布时间：2019-02-09 07:57

【摘要】：目的:血管新生对脑梗死慢性期的大脑重塑和神经功能恢复十分有益[1]。已有研究表明正丁基苯酞Dl-3n-Butylphthalide(NBP)在实验性脑梗死中起脑保护作用,并可促进脑梗死后血管新生[2-5]。然而其促进脑梗死后血管新生的机制尚不是十分明确,其形成的新生血管是否为有功能的血管仍待证实,因为有功能的血管新生对神经功能恢复才是真正有意义的。本实验通过对雄性C57BL/6小鼠实行电烧灼闭塞大脑中动脉(permanent distal middle cerebral artery occlusion,d MCAO)以制备皮层局灶性脑缺血模型,梗死后连续给予消旋正丁基苯酞14天,从促血管生成因子表达、血管密度、血管通透性、脑血流等方面系统地研究脑缺血后血管新生情况,并评价其神经功能改善情况。方法:选择雄性C57BL/6小鼠(年龄8-12周,体重20-25 g)。皮层局灶性脑缺血模型制备需先永久性结扎雄性C57BL/6小鼠小鼠的右侧颈总动脉,然后在体式显微镜下烧灼右侧大脑中动脉的皮层分支。将实验动物随机分为三组,分别为假手术组(Sham),溶剂对照组(Vehicle),用药组(NBP)。于造模后1小时开始腹腔给予药物或等体积溶剂,其中用药组给予NBP(20 mg/kg),假手术组和溶剂对照组给予等体积溶剂0.5%吐温-80,连续14天。分别于造模后1、3、7、14、21、28天对各组小鼠进行疲劳转棒实验(Rotarod Test)以获得神经功能评分,28天后取材并用HE染色法测定脑萎缩体积;于造模后7、14、28天用免疫荧光染色测定血管密度,新生血管增殖率及周细胞包裹率;于造模前、即刻、3、7、14、28天测梗死侧皮层脑血流变化;,于造模后3、7、14天应用蛋白免疫印记(Western blot)检测促血管新生因子如VEGF,Ang-1,N-Cadherin表达情况。结果:1正丁基苯酞可促进实验性脑缺血小鼠的神经功能改善本实验室既往研究发现脑梗死后1小时给予正丁基苯酞20mg/kg对实验性脑缺血小鼠神经功能改善明显优于正丁基苯酞40mg/kg,所以本实验选用对神经功能改善最佳的剂量20mg/kg进行实验研究。造模前所选小鼠均为在转棒上维持时间60秒以上者,而造模1天后Vehicle组和NBP组神经功能缺损症状明显,且未见明显差异;3天神经功能评分NBP组稍优于Vehicle组,但差异无统计学意义(Vehicle VS.NBP:3天:41.97±10.43VS.48.73±3.44(P0.05));自7天起至28天NBP组神经功能评分明显高于Vehicle组,且差异具有统计学意义(Vehicle VS.NBP:7天:44.76±7.35VS.61.42±5.74(P0.05);14天:40.33±8.68 VS.61.91±8.37(P0.05);21天39.91±8.66 VS.59.73±6.41(P0.05);28天34.03±5.10 VS.63.82±3.75(P0.05))(Fig.1A)。说明NBP20mg/kg可明显改善脑缺血小鼠神经功能。2正丁基苯酞对实验性脑缺血小鼠梗死后28天脑萎缩体积无明显影响造模后28天两组小鼠脑萎缩体积差别不大,且无统计学意义(Vehicle VS.NBP:28天:7.56%±1.75%VS.5.77%±1.30%(P0.05))(Fig.1B)。说明正丁基苯酞对脑缺血小鼠脑萎缩体积无影响。3正丁基苯酞促进脑缺血小鼠梗死边缘新生血管增殖同时增加了血管密度造模后第7天脑缺血小鼠梗死边缘开始出现Brdu+血管,即发生新生血管增殖,但两组差别无统计学意义(Vehicle VS.NBP:7天:12.03%±1.64%VS.13.29%±1.85%(P0.05));第14天NBP组梗死边缘Brdu+血管百分比较Vehicle组明显增加,且差别具有统计学意义(Vehicle VS.NBP:14天:13.41%±1.44%VS.24.61%±2.33%(P0.05))(Fig.2 C,D)。据统计,7天时两组小鼠梗死边缘血管密度无差别,14天时发现NBP组小鼠梗死边缘血管密度较Vehicle组明显增多,且差别有统计学意义(Vehicle VS.NBP:14天:11.77%±1.09%VS.14.70%±0.53%(P0.05));到28天NBP组小鼠梗死边缘血管密度仍显著多于Vehicle组,且差别有统计学意义(Vehicle VS.NBP:28天13.61%±0.95%VS.16.68%±0.46%(P0.05))(Fig.2 A,B)。4正丁基苯酞可增加脑缺血小鼠梗死边缘区域微血管周细胞包裹率脑梗死后14天,NBP组脑梗死边缘血管周细胞包裹率较Vehicle相比显著增高,且与差别有统计学意义(P0.05);至脑梗死后28天梗死周边周细胞微血管内皮细胞包裹率较14天增加,且和Vehicle相比差异有统计学意义(P0.05)(Fig.3 A,B)。5正丁基苯酞可改善脑缺血小鼠血脑屏障渗透性脑梗死后7天、14天NBP治疗组脑组织伊文思蓝渗出率(梗死侧/梗死对侧)明显低于Vehicle组,且差别有统计学意义(Vehicle VS.NBP:7天:5.8105±0.58719VS.2.4505±0.09629(P0.05);14天:2.2025±0.17158VS.1.7162±0.12084(P0.05)),从7天到14天再到28天,脑组织伊文思蓝渗出率逐渐减低,28天时脑组织伊文思蓝渗出率降到最低,与正常组织相似(Fig.3 C)。6正丁基苯酞可增加脑缺血小鼠皮层脑血流灌注量激光散斑血流成像结果显示了脑梗死后各时间点的皮层脑血流灌注量,其中可发现梗死后14天NBP组皮层脑血流灌注量比高于Vehicle组,且有统计学意义(P0.05)(Fig.4)。由此我们可推论正丁基苯酞可增加脑梗死小鼠皮层脑血流灌注量。7正丁基苯酞可增加脑缺血小鼠皮层脑组织中调节血管生成与成熟因子VEGF,Ang-1,N-Cadherin的蛋白表达Western Blot结果显示,脑梗死后VEGF、Ang-1、N-Cadherin蛋白在梗死侧大脑皮层表达增高。VEGF在脑梗死后3天表达显著增高,且NBP治疗组表达高于Vehicle组,VEGF表达在7天时仍较显著,差异有统计学意义(P0.05)。Ang1蛋白表达在脑梗死后3天、7天较Vehicle组明显增高,具有统计学差异(P0.05)。N-Cadherin自脑梗死后3天表达开始升高,且NBP组较Vehicle组更高,持续到14天,二者差异具有统计学差异(P0.05)(Fig.5)。结论:正丁基苯酞可以通过增加调节血管新生的细胞因子VEGF,Ang1,N-Cadherin的蛋白表达来促进实验性脑缺血小鼠梗死边缘区血管新生,且其促进生成的新生血管是结构完整的、有功能的血管,同时正丁基苯酞可增加梗死侧皮层脑血流量,促进神经功能恢复。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.3

【参考文献】