信号转导与转录激活子3在β-淀粉样肽诱导的小胶质细胞炎症反应与氧化应激中的作用

发布时间：2019-03-18 19:38

【摘要】：目的:阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)的发病机制目前仍未完全清楚,而β-淀粉样肽(β-Amyloid peptide,Aβ)的神经毒性作用是AD发病过程中的关键环节。为此,本课题研究了 Aβ诱导小胶质细胞产生炎症反应与氧化应激过程中信号转导与转录激活子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的改变及作用。方法:用Aβ寡聚体处理BV2小胶质细胞构建了 AD细胞模型,采用siRNA方法成功沉默BV2小胶质细胞中STAT3的表达实验分为4组,即正常对照组、Aβ处理组、ControlsiRNA+Aβ组以及siRNASTAT3+Aβ组。用CCK-8方法测定小胶质细胞的存活率以筛选Aβ寡聚体的最适刺激浓度和时间;用蛋白印迹法(Westernblotting)检测STAT3在Aβ寡聚体诱导的BV2小胶质细胞中蛋白表达水平;用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR)和酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分别检测ILl-β和TNF-α的mRNA与蛋白的表达水平;用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒测定细胞内ROS水平;用生物化学方法检测一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量、超氧化物歧化酶(Antioxidant enzyme superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(Methane dicarboxylic aldehyde,MDA)含量;用流式细胞术测定细胞凋亡水平;用细胞免疫荧光方法测定细胞内Aβ寡聚体的吞噬清除水平及蛋白印迹法检测细胞上清液中未被小胶质细胞吞噬的Aβ寡聚体水平。实验所得数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果(1)AD细胞模型建立及siRNA处理:不同浓度的Aβ寡聚体对小胶质细胞的毒性作用呈现剂量-效应关系。自0.5 μmol/L浓度起,寡聚体的毒性作用明显,浓度为1.0 μmol/L时,BV2细胞的存活率下降约50%,所以选择1.0 μmol/L浓度的Aβ寡聚体处理BV2细胞。采用siRNA方法沉默STAT3后结果显示,与对照组比较,p-STAT3与总STAT3的mRNA及蛋白表达水平均明显降低,表明该方法成功沉默BV2细胞中STAT3表达。(2)Aβ寡聚体对STAT3蛋白的影响:与正常对照组相比,1.0 μmol/L及以上浓度的Aβ寡聚体处理BV2细胞可使p-STAT3蛋白表达水平明显增高;1.0 μmol/L Aβ寡聚体刺激BV2细胞的时间不同p-STAT3蛋白表达水平增高的程度也不同,其中处理4 h时STAT3磷酸化的水平较其他时间略高;而总STAT3蛋白表达水平没有明显改变。(3)小胶质细胞中IL1-β和TNF-α的表达:siRNA沉默STAT3后,小胶质细胞中IL1-β和TNF-α的mRNA及蛋白的表达水平较对照组相比均显著增高;而siRNA沉默STAT3后再用Aβ寡聚体处理(即siSTAT3+Aβ组)与单纯Aβ处理组相比,IL1-β和TNF-α的mRNA及蛋白的表达水平均明显降低。(4)小胶质细胞中氧化应激水平的变化:Aβ处理组小胶质细胞中ROS、NO和MDA含量均显著增加、SOD活性显著降低;与Aβ处理组相比,siSTAT3+Aβ组细胞ROS、NO和MDA含量显著减少,SOD活性显著增高。(5)小胶质细胞凋亡率:Aβ处理组与正常对照组相比,小胶质细胞凋亡率显著增加;siSTAT3+Aβ组与单纯Aβ处理组相比,细胞凋亡率明显降低,细胞凋亡率由(29.67± 2.53)%降为(15.28 ±1.69)%。(6)小胶质细胞对Aβ寡聚体的吞噬清除:与单纯Aβ3处理组相比,siSTAT3+Aβ组BV2小胶质细胞对Aβ寡聚体的吞噬清除明显增加,所收集的细胞上清液中,残留的Aβ寡聚体显著减少。结论:(1)Aβ寡聚体对小胶质细胞有明显的神经毒性作用,可诱导小胶质细胞产生较强的炎症反应及促进氧化应激水平。(2)Aβ寡聚体可引起小胶质细胞中STAT3活化。(3)siRNA沉默BV2小胶质细胞中STAT3的表达后,可减弱Aβ寡聚体引起的小胶质细胞的炎症反应与氧化应激水平;(4)siRNA沉默BV2小胶质细胞中STAT3的表达后,可降低Aβ寡聚体引起的小胶质细胞凋亡并且促进小胶质细胞对Aβ寡聚体的清除。综上所述,STAT3可能参与调控Aβ诱导的小胶质细胞的炎症反应、氧化应激及细胞凋亡病理过程中的作用机制。
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【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R749.16

【参考文献】