【摘要】：制剂原料的处理工艺和研究水平,是发展中药制剂和保证临床疗效的关键科学问题。科学地认识中药物质基础,才能指导制剂原料的处理过程,保障制剂产品的临床有效性。中药的化学成分繁杂多样,作用于系统整体的病理网络,因此呈现出复杂的"量-效"关系。基于中医药的整体观和系统性,课题组提出中药效应物质基础的本质即"组分结构"的特征性。效应组分之间或组分内各成分存在一定的"量"与"量"的关系,通过复杂的"组分-靶标-效应"关系调控机体达到防治疾病的目的。组分作为中药未来制剂的基本释药单元,发现组分制剂优效原料并科学阐明组分结构特征,基于"组分结构-生物网络"作用关系揭示组分间调控疾病的作用规律和特点,为发展组分中药制剂奠定基础。本课题以牡丹皮萜苷-多糖双组分为研究对象,解析制剂原料的组分结构特征,依据病理模型探讨组分及组分间调控疾病的作用特点。采用网络药理学的数据挖掘技术,通过建立多成分与病理靶标的关系描述,确认牡丹皮调控糖尿病肾病的活性组分,并解析组分的组成结构特征。建立糖尿病肾病大鼠模型,紧扣疾病的发病机制,评价"组分-药效"关联性,确认牡丹皮组分制剂原料防治疾病的有效性。采用基因表达谱芯片以及通路分析,基于组分调控疾病的多环节效应,研究不同组分在多个靶点和通路上的协同作用关系,为构建以组分为基本单元的释药系统奠定研究基础。本研究以生物效应为出发点,以明确的组分结构为前提,为发现有效、稳定的中药组分制剂原料提供了研究思路。主要研究内容包括:1.基于网络药理学技术构建多成分-多靶点作用关系挖掘牡丹皮调控糖尿病肾病的活性组分依据Pubchem数据库、化学数据库并结合TCMSP数据库,以OB(口服生物利用度)20%、DL(类药性)0.18为筛选指标,确定了牡丹皮中的31个主要成分。采用药物靶点预测模型结合文本挖掘进行活性成分的靶点预测,获得牡丹皮的潜在靶点130个。对靶点进行标准化之后,利用MAS 3.0生物分子功能注释系统,进行基因的GO功能分析和通路注释分析。结果表明:牡丹皮的潜在调节通路有78条,其中与DKD发病机制相关的通路有32条,可能主要介导了细胞外基质、炎症反应、氧化应激等生物过程。从构建的牡丹皮成分-靶点-作用途径的网络图分析发现,牡丹皮调控DKD的分子机制呈现多成分、多靶点、多途径的特点,每个活性成分往往调控多个靶点,而且靶点蛋白之间往往共享配体,呈现出生物系统的网络性。网络拓扑分析提示萜苷类组分是牡丹皮调控糖尿病肾病的主要活性组分。2.牡丹皮防治糖尿病肾病的制剂成型前原料的物质基础组分结构解析根据文献研究以及前期实验结果,确认牡丹皮萜苷(MC-TG)以及多糖(MC-P)组分是牡丹皮发挥调控糖尿病肾病的活性组分。在本章中进行了组分的制备研究,并解析其组成结构特征。首先采用D101大孔树脂,按照课题组前期优化的实验条件,对MC-TG进行了分离研究,结果表明:经该法分离的MC-TG,得率为3.67%。以芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷为代表性成分,计算萜苷组分的含量为45.5%,组分内各单体成分的结构比例为:芍药苷:氧化芍药苷:苯甲酰芍药苷=3.41:2.48:1.00。其次,采用DEAE-52离子交换层析柱对粗多糖进行分级纯化,获得了 MC-Pa、MC-Pb两个均一性多糖,并对其进行了理化性质、结构分析、单糖组成等研究,结果得出:牡丹皮总多糖的得率为1.6%;MC-Pa、MC-Pb的质量比为:3.18:1.63;MC-Pa的总糖含量为86.5%,蛋白质含量为1.67%;MC-Pa、MC-Pb都是由甘露糖、L-鼠李糖、半乳糖醛酸、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、木糖构成,但是其各单糖的含量相差较大。MC-Pa中各单糖的组成比例为:甘露糖:L-鼠李糖:半乳糖醛酸:D-葡萄糖:L-阿拉伯糖:木糖=1.00:2.25:3.21:5.89:2.52:6.22。而MC-Pb中各单糖的组成比例为:甘露糖:L-鼠李糖:半乳糖醛酸:D-葡萄糖:L-阿拉伯糖:木糖=1.00:0.71:2.75:0.19:0.69:1.95。IR和UV解析表明两者均具有多糖的特征吸收图谱。3.牡丹皮萜苷-多糖双组分干预糖尿病肾病大鼠:基于肾脏损伤的发病机制评价"组分-药效"关联性本章通过建立DKD大鼠模型,以肾功能参数、肾脏病理组织学检查并结合与DKD发病机制密切相关的细胞因子为指标,评价牡丹皮"萜苷/多糖双组分-药效"关联性。结果显示:牡丹皮萜苷-多糖双组分能够有效降低血糖、血肌酐、血尿素氮、尿总蛋白的含量;改善肾小球基底膜增厚、间质炎性细胞浸润、足细胞结构损伤;下调大鼠血清中AGEs与RAGE的含量;抑制肾脏组织FN及Col IV蛋白的表达;调节大鼠肾脏及血清中VCAM-1及IL-lβ等炎症因子;提高血清中T-SOD、GSH-PX的活性。这部分研究提示牡丹皮萜苷-多糖双组分能够显著改善DKD大鼠的肾损伤,效果优于MC-TG或MC-P组分单独给药,且与牡丹皮总提物的调节作用相当,说明牡丹皮萜苷-多糖双组分在药效上可以等同于总提取物,而目.各活性组分具有调节差异,有相互协同的作用。4.基于"组分结构-生物网络"的整合调控效应探讨牡丹皮萜苷-多糖双组分干预糖尿病肾病的作用特点(1)通过基因表达谱芯片对比分析各活性组分的调控效应差异,在mRNA的水平探讨牡丹皮萜苷-多糖双组分干预糖尿病肾病的交互作用特点。结果显示:模型组与空白相相比,差异基因的数目最多,其中上调的基因数有859,下调的基因数有652,推测造模后大鼠的生物网络出现紊乱;牡丹皮双组分组与模型组相比,上调的基因数为808,下调的基因数为537,说明其可调控多个基因的表达,有很强的生物网络调控作用。牡丹皮双组分组与空白组相比,差异基因的数目远远小于与模型组的比较,提示牡丹皮双组分有调节网络恢复正常的可能性。此外,通过分析差异基因的功能得知:牡丹皮双组分可能主要参与的生物过程有药物反应、炎症反应、氧化应激等;而MC-TG组分可能主要参与了生化反应、药物反应、炎症反应等生物过程;MC-P组分可能主要参与的生物过程有生化反应、氧化还原反应、氧化应激等。可见,牡丹皮萜苷-多糖双组分能够干预DKD病理网络的多个靶点、参与多个生物过程,而且各个组分都有调节生物过程的侧重点,呈现多环节调控的协同交互作用。(2)基于牡丹皮作用靶点和通路的分析、药效评价以及基因芯片的结果,开展深入的分子机制研究,阐明各活性组分调控不同病理环节的作用。研究发现:在调节系膜炎症反应方面,MC-TG组分可通过调节IRElα/NF-κB p65通路抑制内质网应激(ERS)介导的炎症反应;在抗氧化应激方面,MC-P组分具有显著的抗氧化活性以及抑制AGEs诱导的ROS产生;在对抗细胞外基质沉积方面,MC-TG组分能够调节TGF-β1/pβ8MAPK通路发挥抑制作用;可见,基于"组分结构-生物网络"的作用关系,牡丹皮不同活性组分通过调节不同的靶标与通路,协同性干预糖尿病肾病的发生发展。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
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本文编号：2476826
