基于药对作用的新生化颗粒配伍效应与物质基础研究

发布时间：2019-09-11 08:16

【摘要】：本论文研究工作为国家自然科学基金资助项目—"当归-红花配伍养血活血量效关系与协同增效相互作用研究"和"江苏省方剂高技术研究重点实验室/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心项目"的部分实验内容。论文共分为四章,第一章综述了药对和新生化颗粒的研究进展。第二章到第四章为实验部分,其具体的研究内容和相应结论如下:第二章基于当归系列药对的新生化颗粒配伍效应研究第一节基于当归系列药对的新生化颗粒的养血作用配伍效应研究采用撤药分析法比较评价当归系列药对在新生化颗粒中的养活作用贡献,养血指标主要包括外周血常规参数、脏器指数、Na+-K+和Ca2+-Mg2+ATP酶活性。采用环磷酰胺和乙酰苯肼联合复制血虚小鼠模型;与正常组小鼠相比,模型组小鼠的外周血常规、脏器指数和ATP酶活性均有显著性差异(P0.01),表明血虚模型复制成功。给予新生化颗粒(XSHG)及新生化颗粒缺失当归系列药对样品后(DY、DC、DT、DH、DJ和DZ)后,各给药组小鼠的各相关养血效应的指标均有不同程度的改善。进一步将各给药组的药效数据经过主成分分析(PCA),采用各给药组到空白组的相对距离法来比较当归系列药对在新生化颗粒中的养血作用。各给药组的养血作用的大小顺序为:XHSGDJDTDZDHDCDY。结合多指标综合指数法的分析数据,表明当归系列药对在新生化颗粒中药学效应方面皆有作用,当归-益母草和当归-川芎药对在方中的养血贡献程度最大。该方法为新生化颗粒的临床合理应用提供了科学依据,并为复杂方剂的配伍研究提供了方法的参考。第二节基于当归系列药对的新生化颗粒的活血作用配伍效应研究比较评价新生化颗粒缺失当归系列药对前后对急性血瘀大鼠血液流变学和凝血功能的影响,探讨当归系列药对在新生化颗粒中的活血作用贡献。采用冰水浴和皮下注射盐酸肾上腺素共同复制急性血瘀大鼠模型。根据全血黏度(WBV)、血浆黏度(PV)、血沉(ESR)和红细胞压积(HCT)等指标,观察新生化颗粒缺失当归系列药对前后对急性血瘀大鼠血液流变学的影响;以血小板最大聚集率(ADP)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆纤维蛋白原含量(FIB),观察新生化颗粒缺失当归系列药对前后对血瘀大鼠的血小板聚集和凝血功能的影响。采用多指标综合指数法和主成分分析法综合评价当归系列药对在新生化颗粒中的活血作用贡献。研究结果显示,与正常组比较,模型组的各血液流变学和凝血功能指标均有统计学差异(P0.01);与模型组比较,新生化颗粒缺失当归系列药对前后对急性血瘀大鼠的血液流变学和凝血功能的多个指标皆有一定的改善作用。多指标综合指数法和主成分分析法综合评价得出,新生化颗粒对血瘀大鼠的调节作用优于拆方组和生化汤组;新生化颗粒缺失当归系列药对后,各给药组的活血效应均有一定程度的降低;缺失不同的当归药对后对原方的活血效应影响不同,当归系列药对在新生化颗粒中的活血作用贡献的顺序为:当归-益母草当归-川芎当归-红花当归-炙甘草当归-桃仁当归-姜炭。该研究表明,当归系列药对是新生化颗粒的重要组成部分,不同的当归系列药对在新生化颗粒中的活血作用贡献不同;且当归-益母草药对在全方中的活血作用贡献最大,与新生化颗粒的组方结构(重用益母草)以及益母草"活血行滞、祛瘀生新"的功效相一致,与前期当归系列药对在新生化颗粒中的养血血效应贡献度一致。第三章新生化颗粒体内外效应物质基础研究第一节新生化颗粒配伍前后的主要效应成分含量变化研究新生化颗粒来源于经典名方生化汤,临床上常用来治疗产后疾病。它的效应成分主要包括:芳香酸类、苯酞类、生物碱类、黄酮类和姜辣素类成分。为比较新生化颗粒七个单味药配伍前后效应成分的含量变化,本文首次建立了超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法(UHPLC-TQ/MS)同时测定新生化颗粒及其单味药中27个效应成分的含量。在优化的色谱条件下,27 个效应成分在 20 min 内于 Thermo Scientific Hypersil GOLD(100 mm × 3 mm,1.9μm)色谱柱上得到了较好的分离。结果显示:除了胸腺嘧啶、对香豆酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H和藁本内酯外,其它有效成分的含量配伍后均显著性增加;不同类型化合物配伍前后的变化率的顺序为:姜辣素类黄酮类芳香酸类生物碱类苯酞类。该方法为新生化颗粒的质量控制提供了参考,同时也有助于阐明新生化颗粒的药物相互作用规律。第二节当归系列药对在新生化颗粒中的效应物质基础研究综合前期的活血、养血作用贡献的效应整合结果,皆表明药对当归-益母草和当归-川芎在方中的贡献程度大。基于此,从各拆方样品中效应成分的含量变化方面揭示当归系列药对在新生化颗粒中不同贡献的潜在原因。本实验采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(UHPLC-TQ-MS/MS)法比较评价新生化颗粒及其拆方样品中有效成分的含量变化。结果表明,与新生化颗粒组相比,大部分效应成分在其拆方样品中皆有不同程度的降低;在样品DY中,除了甘草素外,其它效应成分较新生化颗粒中相应的成分均有不同程度的降低。进一步将各样品中效应成分的含量做标化后做PCA分析,其中,DY和DC样品组距XSHG组最远,从化学成分含量角度表明了药对当归-益母草和当归-川芎在新生化颗粒的贡献程度较大的原因。该方法为阐明当归系列药对在新生化颗粒的配伍规律奠定了基础。第三节新生化颗粒在正常和血虚模型大鼠体内的药代动力学比较研究建立新生化颗粒中15个效应成分在大鼠血浆中的UPLC-MS/MS的测定方法,比较评价主要效应成分在正常和血虚模型大鼠灌胃给药新生化颗粒后的药物代谢动力学的行为差异。新生化颗粒在正常和血虚模型大鼠的灌胃剂量均为9.72 g·kg-1。15个效应成分在血浆中的线性关系良好(r ≥ 0.9925),所有分析物的日间和日内精密度分别小于10.88%和11.87%,相应的准确度相对误差在±12.38%范围内。除了甘草酸以及甘草次酸,新生化颗粒中其它效应成分在正常和血虚模型大鼠中Tmax和t1/2均较短,在6小时内基本消除完全;较空白组相比,模型组中除了苦杏仁苷、甘草苷和甘草次酸,其它效应成分的药动学行为均有明显的差异;整体而言,各类效应成分在模型大鼠中的AUC0-t、AUC0-∞均明显高于正常大鼠(P0.05),Tmax均有不同程度的提前。表明在血虚病理状态下,通过激活血虚大鼠体内的代谢酶的活力,使得效应成分的代谢速率和程度被改变。其中,以水苏碱和益母草碱为代表的生物碱类,在体内较长时间保持较高的血药浓度,提示生物碱类成分可能是新生化颗粒发挥养血效应的重要活性成分,其养血作用机理需要进一步研究。第四章基于代谢组学和网络药理学的新生化颗粒养血作用机制研究第一节基于代谢组学的新生化颗粒的养血作用机制研究采用大鼠眼底静脉丛放血法复制大鼠失血性血虚模型,共分为失血性模型组、正常组、新生化颗粒组、生化汤组、当归-益母草组,当归组和益母草组。应用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF/MS)技术,对各组大鼠血浆中内源性代谢物进行分析,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)对血浆中内源性标记物进行多元数据统计分析,并基于SPSS19.0对潜在差异性标记物进行P检验。结果显示,PCA中血虚大鼠与其他各组能够达到基本分离;进一步对潜在的差异性标记物定性鉴定,共鉴定出18个差异性标记物。与正常组相比,模型组中8-异前列腺素F2a、神经鞘氨醇、溶血卵磷脂LysOPC(20:4)、磷酸泛酰半胱氨酸、15-脱氧-d-12,14-前列腺素J2、脱氧胆酸、脱氧核糖胸腺苷酸、9-反式-视黄酸、亮氨酸-苯丙氨酸、L-胱硫醚、泛醌-2、鞘氨醇1-磷酸、S-腺苷高半胱氨酸、16-羟基孕烯醇酮和4-氧化-视黄酸的含量显著增加(P0.01);模型组中16-去氢黄体酮、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的含量明显降低(P0.05)。在各给药组的大鼠体内,这些差异性内源性物质得到了不同程度的恢复。采用Matlab构建血虚相关通路分析,失血性血虚模型主要泛酸和辅酶A的生物合成、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、鞘脂类代谢有关。不同给药组可以调节以上紊乱的3条代谢通路向正常转归,其药效学和内源性标记物的代谢轨迹的结果均显示,不同给药组对失血模型大鼠的改善程度为:XSHGSHDDYDGYMC。第二节基于网络药理学的新生化颗粒的养血作用靶点预测采用网络药理学方法对新生化颗粒中58个潜在效应成分的养血分子作用机制进行分析,探讨其多成分、多靶点、多通路的相关关系。依据PharmMapper、SEA、STITCH、Drugbank等数据库和文本挖掘的方法构建了与46个血虚相关的靶蛋白;然后将获得靶蛋白导入KEGG数据库建立血虚相关作用通路;最后,采用Cytoscape软件建立新生化颗粒成分-靶点-通路网络模型。养血效应方面,新生化颗粒中58个效应成分涉及46个作用蛋白和24条作用通路;24条作用通路主要涉及血虚过程中的红细胞功能、免疫功能、能量代谢、炎症因子和血管微循环;其中,预测到的24条血虚代谢通路与前期的代谢组学有7条吻合。文献研究和本课题组的代谢组学研究结果均证实了网络预测的可靠性。该结果体现了新生化颗粒的多成分、多靶点、多途径作用模式,为深入研究新生化颗粒的养血的分子作用机制提供参考。第三节新生化颗粒养血效应的关键靶点验证课题组前期采用代谢组学和网络药理学对新生化颗粒的养血机制进行了探索性研究。研究结果均表明,产后血虚证主要和能量代谢紊乱、血液微循环障碍、红细胞合成降低、炎症爆发以及免疫功能降低有关。基于以上的分析结果,本节对新生化颗粒潜在养血代谢通路上的关键靶蛋白进行了生物活性验证。研究结果发现,新生化颗粒通过提高机体的EPOR、F2、TNF-α、IL-6、ACSS1、COASY、AHCY 和 CBS 的表达,降低体内 S1PR1、SPHK1和HIF-1α的含量,继而改善血虚状态下的能量代谢紊乱、血液微循环障碍和增强红细胞功能而发挥养血作用。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
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本文编号：2534306