基于网络药理学的玉屏风散有效成分改善小鼠接触性皮炎的机制研究

发布时间：2019-09-26 00:53

【摘要】：接触性皮炎(Contact dermatitis)是一种迟发型超敏反应疾病。此类疾病是抗原诱导的一种T细胞免疫应答反应,是效应T细胞与特异性抗原结合作用引起的以单核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎症反应。此类炎症反应发生较慢,通常在接触相同抗原后24-72小时出现,因此又被称为迟发型超敏反应(DTH)。此类反应的发生与抗体无关,只与效应T细胞和吞噬细胞及其产生的细胞因子或细胞毒性介质有关。玉屏风散是一副中药名剂,由黄芪、防风和白术三个单味药构成,有记载的使用历史已有千年之久,目前临床主要用于治疗过敏性鼻炎、上呼吸道反复感染等过敏性疾病。首先,使用网络药理学分析方法,通过数据库检索构建与接触性皮炎、超敏反应相关的蛋白质-蛋白质相互作用网络模型;通过反向分子对接构建构建玉屏风散中有效成分可能作用的靶点网络。整合上述两个网络,获得了 23个关键节点蛋白,这些蛋白可能是玉屏风散改善接触性皮炎分子机制中的靶点蛋白,分别为 HSP90AA1、ESR1、CDK2、ELANE、F2、PPP1CC、LCK、PCK1、NR3C1、PGR、CCNA2、SRC、BTK、ABL1、CASP1、DPP4、JAK2、KIT、PRKCQ、GRB2、PYGL、HPGDS。在20个用于反向分子对接的小分子化合物中,有13个化合物预测到YPFS可以通过Hsp90改善接触性皮炎反应,提示Hsp90可能是玉屏风散改善接触性皮炎的重要靶点。热休克蛋白90(Hsp90)是广泛存在于细胞内的一类高度保守的分子伴侣蛋白,通过维持其客户蛋白的稳定与活性而间接调控细胞内多条信号转导通路。将上述得到的23个蛋白再与数据库中检索的得到的Hsp90客户蛋白进行交集,发现其中其中有6个蛋白是Hsp90的客户蛋白,分别是SRC、CDK2、LCK、PRKCQ、CCNA2和NR3C1。提示Hsp90不仅可以自己作为潜在靶点影响下游信号通路改善接触性皮炎,同时也可以作为分子伴侣影响其他潜在靶点活性来改善接触性皮炎。本文选用玉屏风散各单味药的有效成分及其组合物来治疗2'4-二硝基氟苯(DNFB)致Balb/C小鼠CD模型,使用ELISA、qPCR和流式细胞术在分子和细胞水平上检测细胞因子含量的变化以及耳组织切片病理状况变化来评价各有效成分的治疗效果。并且使用免疫印记来检测Hsp90、Akt蛋白量的变化以及对下游NF-κB(p65)入核活化的影响进一步研究玉屏风散抑制炎症反应的机制。ELISA结果表明玉屏风散有效成分可以改善模型鼠血清IFN-γ上升;qPCR结果表明,玉屏风散有效成分可以改善模型鼠脾脏组织中IFN-γ、IL-2和TNF-α的mRNA水平。免疫印记显示出,黄芪甲苷和白术内酯Ⅰ可以显著降低Hsp90和Akt含量,进而抑制了 NF-κB的活化。并且结果显示出黄芪甲苷和白术内酯Ⅰ相对于升麻素苷和5-O甲基维斯阿米醇苷有更好的抗炎作用。这说明Hsp90可能是玉屏风散改善接触性皮炎的靶点。LPS刺激巨噬细胞可以引起Hsp90蛋白量上升,并且活化NF-κB信号通路。同时,LPS刺激可以引起COX-2表达上调,引起下游前列腺素含量上升,导致细胞产生炎症反应。我们用玉屏风散中的四个有效小分子化合物预孵Raw264.7细胞1.5h后使用LPS刺激,24h后检测培养基中TNF-α和NO含量,进一步观察玉屏风散有效成分的抑制炎症作用,然后再使用免疫印记检测Hsp90和Akt蛋白量以及NF-κB信号通路的活化情况。结果显示四种有效成分都有一定的抑制炎症作用,培养基中TNF-α和 NO含量较于阴性对照均有下降,其中黄芪甲苷和白术内酯Ⅰ给药组的改善作用比较明显。免疫印记结果表现出黄芪甲苷和白术内酯Ⅰ可以明显减少Hsp90和Akt的蛋白量,从而抑制NF-κB活化,改善炎症反应。综上所述,Hsp90可能是玉屏风散改善接触性皮炎的靶点,并且通过影响其客户蛋白Akt的稳定来抑制下游NF-κB信号通路的活化改善炎症反应。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】