皮质酮启动增强小胶质细胞免疫炎症机制初探及淫羊藿黄酮类成分干预研究

发布时间：2019-11-15 01:43

【摘要】：研究背景和目的:抑郁症具有高发病率和高死亡率特点严重危害人类生产生活,目前,抑郁症的发病机理仍不十分清楚,安全有效临床治疗抑郁药物相对匮乏。本课题组及其他学者前期研究表明,抑郁症发生发展与中枢神经炎症密切相关。小胶质细胞是中枢神经系统常驻免疫细胞,当机体感受到内源性和/或外源性危险信号时,小胶质细胞可被迅速激活,释放大量炎性细胞因子,清除危险信号,维持内环境稳态。抑郁症尸检报告显示患者前扣带回皮层小胶质细胞激活和炎性细胞因子增加。本课题组前期在抑郁症模型动物前额皮层功能脑区上观察到类似现象,提示小胶质细胞激活及合成释放炎性细胞因子可能是引发抑郁症中枢神经炎症的关键病理环节。应激是抑郁症发生发展的重要诱因,本课题组在慢性应激诱导抑郁症模型大鼠上检测到下丘脑-垂体-肾上腺轴激活,糖皮质激素皮质酮水平升高,但所升高的糖皮质激素与中枢小胶质细胞激活及其介导神经炎症之间是否存在内在联系?作为经典的免疫抑制剂和抗炎剂,糖皮质激素可通过何种机制激活小胶质细胞和增强其介导的神经免疫炎症反应?这些问题亟待探究。之前有研究证实,慢性应激或外源性糖皮质激素预处理动物后,分离海马小胶质细胞并给予炎性因子刺激,可检测到更快更强的免疫炎症反应,提示糖皮质激素除经典的抗炎作用外,还可能导致小胶质细胞处于"启动增强"(priming)状态,从而对随后炎性因子刺激产生了更强的炎性应答反应。目前对这一现象及其可能的机制探究仍不充分。另一方面,临床和基础研究已证实淫羊藿黄酮类成分具有增强免疫功能、抗抑郁行为样作用,本课题组前期研究发现淫羊藿黄酮类成分可改善下丘脑-垂体-肾上腺轴功能而发挥其抗抑郁作用,但这些成分对应激水平皮质酮所引起的小胶质细胞病理改变的逆转作用及其分子作用机制需进一步阐明。本文拟利用应激水平糖皮质激素(皮质酮)体外刺激小鼠小胶质细胞,确证其启动增强小胶质细胞免疫炎症反应的可能作用模式与机制。并在上述模型上,评价淫羊藿黄酮类成分对皮质酮启动增强小胶质细胞的调控作用和机制,以发现基于干预启动增强状态小胶质细胞新途径的潜在抗抑郁中药成分。实验方法:皮质酮(25 nM)预处理小鼠小胶质瘤BV2细胞24 h后,加入不同浓度的炎性因子脂多糖(LPS)1、5、10、50和100 ng/mL处理4 h,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)方法检测细胞中白细胞介素1β(IL-M)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达水平;皮质酮(25nM)预处理BV2细胞24 h后,加入LPS(5ng/mL)处理2h,采用免疫印迹(Western blotting)方法检测细胞核内核转录因子κB(NF-κB)P65和全细胞NF-κB p-p65蛋白水平;皮质酮(25 nM)预处理BV2细胞24 h后,加入LPS(5 ng/mL)处理,在不同时间点上采用Western blotting方法检测总IL-1β、IL-1β成熟体蛋白水平以及Nod样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)蛋白水平;皮质酮(25 nM)预处理BV2细胞24h后,Western blotting检测NLRP3蛋白水平;采用q-PCR方法检测皮质酮(25 nM)预处理BV2细胞24 h后糖皮质激素受体靶基因NLRP3、SGK、GILZ、MKP-1的mRNA表达水平。利用混合胶质细胞摇床法提取分离纯化Sprague-Dawley新生大鼠原代小胶质细胞,采用免疫荧光化学法标记离子钙接头分子蛋白-1(Iba-1)检测所获得的原代小胶质细胞纯度;同时采用q-PCR方法检测皮质酮(25 nM)预处理原代小胶质细胞24 h后以及再加入LPS(5 ng/mL)处理4 h条件下,NLRP3、IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平;采用Western blotting方法检测皮质酮(25nM)预处理原代小胶质细胞24h后,加入LPS(5 ng/mL)处理2 h后,细胞p-p65蛋白水平,以及加入LPS(5 ng/mL)处理8 h后检测IL-1β总蛋白和成熟体蛋白水平、NLRP3和Caspase-1蛋白水平。另外,皮质酮(20mg/kg)皮下注射C57BL/6小鼠三周,采用q-PCR方法检测小鼠海马组织NLRP和IL-1βmRNA表达水平;采用免疫荧光化学法标记小鼠海马组织Iba-1和NLRP3,检测小胶质细胞NLRP3表达水平;采用Western blotting方法检测小鼠海马组织NLRP3、p-p65、总IL-1β、IL-1β成熟体和Caspase-1蛋白水平。采用MTT比色法检测淫羊蕾黄酮类成分(淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B和朝蕾定C)处理BV2细胞24h时细胞活力变化以选择干预剂量;采用q-PCR方法检测皮质酮(25dnM)预处理BV2细胞24h后,加入LPS(5 ng/mL)处理4 h时各成分对IL-1β mRNA表达水平的影响;采用Western blotting方法检测皮质酮(25 nM)预处理BV2细胞24h后,加入LPS(5 ng/mL)处理2 h时各成分对p-p65蛋白水平的影响及8 h时各成分对总IL-1β、IL-1β成熟体蛋白水平以及NLRP3、Caspase-1蛋白水平的影响;采用q-PCR和Western blotting方法检测皮质酮(25 nM)处理BV2细胞24h时各成分对NLRP3 mRNA和蛋白水平的影响。实验结果:与空白对照组比较,皮质酮预处理BV2细胞24 h后加入LPS处理4 h时,LPS单独处理组细胞IL-1β(p0.001)和TNF-α(p0.001)的mRNA表达水平显著升高,皮质酮处理组则无显著性变化(p0.05);而与LPS单独处理组比较,皮质酮预处理+LPS处理组IL-1β(p0.05)和TNF-α(p0.05)的mRNA表达水平则进一步显著升高。与之一致的是,与空白对照组比较,LPS单独处理组细胞核内p65(p0.01)和全细胞p-p65(p0.05)蛋白水平显著升高;而与LPS单独处理组比较,皮质酮预处理+LPS处理组细胞核内p65(p0.05)和全细胞p-p65(p0.05)的蛋白水平进一步显著升高。皮质酮预处理BV2细胞24 h后,加入5 ng/mL的LPS处理8 h时,与空白对照组比较,LPS单独处理组细胞总 IL-1β(p0.01)、IL-1β 成熟体(p0.001)以及 NLRP3(p0.01)和Caspase-1(p0.001)蛋白水平显著升高;而与LPS单独处理组比较,皮质酮预处理+LPS处理组总 IL-1β(p0.01)、IL-1β 成熟体(p0.001)以及 NLRP3(p0.05)和Caspase-1(p0.001)蛋白水平显著升高。值得注意的是,与空白对照组比较,皮质酮预处理BV2细胞24h即可诱导NLRP3(p0.05)、糖皮质激素受体其它靶基因SGK(p0.05)、GILZ(p0.05)和 MKP-1(p0.05)mRNA 以及NLRP3蛋白(p0.01)水平显著升高。另外,在原代Sprague-Daw1ey大鼠小胶质细胞上观察到类似的现象:皮质酮(25 nM)预处理原代小胶质细胞24 h后,加入LPS(5 ng/mL)处理4 h时,与空白对照组比较,LPS单独处理组IL-1β(p0.05)和TNF-α(p0.001)mRNA表达水平显著升高,皮质酮处理组则无显著性变化(p0.05);而与LPS单独处理组比较,皮质酮预处理+LPS处理组的IL-1β(p0.01)和TNF-α(p0.01)mRNA表达水平显著升高。与空白对照组比较,LPS单独处理组p-p65蛋白水平显著升高(p0.05),而与LPS单独处理组比较,皮质酮预处理+LPS处理组p-p65蛋白水平进一步显著升高(p0.05)。皮质酮预处理原代小胶质细胞24 h后,加入LPS处理8h时,与空白对照组比较,LPS单独处理组总IL-1βp(p0.01)、IL-1β 成熟体(p0.05)以及NLRP3(p0.01)和 Caspase-1(p0.05)蛋白水平显著升高;而与LPS单独处理组比较,皮质酮预处理+LPS处理组总IL-1β(p0.05)、IL-1β 成熟体(p0.01)以及 NLRP3(p0.01)和 Caspase-1(p0.01)蛋白水平显著升高;同时与空白对照组相比,皮质酮预处理原代小胶质细胞24h可诱导NLRP3mRNA(p0.01)和蛋白(p0.01)表达水平显著升高。皮质酮(20mg/kg)皮下注射(5mL/kg)C57BL/6小鼠三周,与空白对照组比较,小鼠海马组织NLRP3mRNA(p0.01)和蛋白(p0.001)表达水平显著升高;免疫荧光化学法初步结果显示小胶质细胞NLRP3表达量升高,而对1L-1βmRNA表达水平和p-p65、总IL-1β、IL-1β成熟体和Caspase-1蛋白水平无显著影响。通过MTT法以处理BV2细胞24 h后细胞活力大于80%为标准确定各个中药成分的干预剂量:淫羊藿苷和宝蕾苷Ⅰ均为2.5、5和10μM;朝蕾定A、朝蕾定B和朝蕾定C均为0.25、0.5和1μM。皮质酮(25 nM)+各中药成分预处理BV2细胞24h后,加入5ng/mL LPS处理4h时,淫羊藿苷(p0.01)、宝藿苷Ⅰ(p0.001)、朝藿定 A(p0.01)、朝藿定B(p0.05)和朝蕾定C(p0.01)显著下调BV2细胞IL-1β mRNA表达水平。同时,在皮质酮+中药成分预处理BV2细胞24h后,LPS处理2h时,淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、朝蕾定A、朝藿定B和朝藿定C显著下调p-p65蛋白水平(p0.01)。皮质酮+中药成分预处理BV2细胞24h后,LPS处理8h时,淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、朝蕾定A、朝藿定B和朝藿定 C 显著下调 NLRP3(p0.01)、Caspase-1(p0.01)、总 IL-1β(p0.01)和IL-1β成熟体(p0.01)蛋白水平。皮质酮+中药成分处理BV2细胞24h时,朝藿定A、朝藿定B和朝蕾定C显著下调NLRP3mRNA(p0.05)和蛋白(p0.05)表达水平,而淫羊藿苷和宝蕾苷Ⅰ对模型细胞NLRP3mRNA和蛋白水平无显著影响(p0.05)。小结:本文研究结果表明,皮质酮预处理可通过诱导小胶质细胞NLRP3mRNA和蛋白表达,使之对随后LPS刺激产生更强更迅速的炎症应答,显示出启动增强(priming)小胶质细胞免疫炎症反应的效应。淫羊蕾黄酮类成分淫羊蕾苷、宝蕾苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C可通过抑制p-p65蛋白水平和NLRP3炎症小体的激活改善皮质酮primingLPS诱导的小胶质细胞免疫炎症反应;其中朝藿定A、朝藿定B和朝蕾定C可通过下调皮质酮诱导NLRP3mRNA和蛋白表达,抑制NLRP3炎症小体的激活,从而改善皮质酮对LPS诱导小胶质细胞免疫炎症反应的priming效应。本文研究工作在一定程度上阐述了应激状态下糖皮质激素对小胶质细胞炎性priming效应机制,发现淫羊藿黄酮类成分的逆转作用,为淫羊蕾防治中枢神经炎症及应激相关抑郁症等提供了实验依据。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】