没食子酸抗缺血性脑中风作用及其线粒体机制研究

发布时间：2020-01-21 18:01

【摘要】：目的:缺血性脑中风是一类严重危害人类身体健康的心脑血管疾病。大量研究证明线粒体在缺血再灌注阶段的神经细胞程序性死亡过程中发挥重要作用,并已成为一个有效干预脑中风神经损伤的新靶点。没食子酸(Gallic acid,GA)是一种来源于掌叶大黄、大叶桉、山茱萸等植物的一种多酚类化合物,具有显著的抗氧化功效。为进一步研究GA是否具有对抗缺血性脑中风作用,并论证其作用是否与靶向线粒体有关,进行了本研究,本研究将为GA应用于缺血性脑中风提供了新的理论基础和实验依据。方法:为研究GA对缺血性脑中风的药效学效应,在第一部分在体试验中采用大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)的方法建立实验性缺血性脑中风模型,分设假手术组(Sham)、模型组(MCAO)、MCAO+GA 25 mg/kg组、MCAO+GA 50mg/kg组、MCAO+CSA 10 mg/kg组,比色法检测缺血半暗带神经细胞SOD活力,HE染色检测脑组织细胞变化,TTC法检测脑梗死体积,TUNEL染色法检测神经元凋亡情况,Western blot法检测检测Cyt C的释放水平。离体试验部分,采用Na_2S_2O_4法构建缺氧复氧损伤细胞模型,分别预作用以不同浓度的GA(0.1、1、10μmol/L)后,MTT法检测细胞活性,DCFH-DA荧光探针法检测ROS含量,Mitosox red荧光探针法检测线粒体ROS,Clark氧电极测细胞耗氧量,荧光素酶法测细胞内ATP含量。通过以上试验系统评价GA的抗缺血性脑中风作用,并对其是否具有保护线粒体功能的性质进行初步探讨。为进一步明确GA保护线粒体功能的相关位点,在第二部分离体实验试验中采用H_2O_2法构建了细胞mPTP开放模型,MTT法检测细胞活性,Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测细胞凋亡水平,JC-1染色、Calcein AM-CoCl_2和Cyt C免疫染色评估mPTP的开放程度,比色法检测细胞SOD活力及MDA含量,Western blot法检测Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9,以及Cyt C的释放水平。在体试验部分,提取小鼠离体肝脏线粒体,Calcium Green5N荧光标记后,使用瞬态稳态荧光光谱仪检测离体线粒体对钙离子的摄取能力。通过以上试验,系统评价了GA靶向mPTP保护线粒体功能的作用。为明确GA作用mPTP的相关作用机制,在第三部分在体试验中提取小鼠离体肝脏线粒体,Ca~(2+)刺激离体线粒体后,免疫共沉淀法检测CypD与ANT-1的结合程度,酶标仪检测GA对CypD的氨基脯氨酸顺反异构酶活性的影响,建立MCAO模型,TTC法检测脑梗死体积,离体实验试验中采用H_2O_2法构建了细胞mPTP开放模型,Western blot检测Cleaved caspase-3、CypD、p-ERK的表达水平,Calcein AM-CoCl_2染色评估mPTP的开放程度,最后采用ERK通路抑制剂U0126分别从在体和离体两个层面反向验证以上GA作用是否是通过调控ERK通路发挥保护作用。结果:在第一部分中,本研究组发现GA可有效对抗MCAO及Na_2S_2O_4所致的神经细胞缺氧复氧损伤。与模型组相比,GA50 mg/kg组大鼠大脑梗死体积,TUNEL阳性细胞数,Cyt C释放量均显著性下降,此外,预防性给予GA后大鼠脑神经细胞SOD水平有显著性升高,这些结果均提示GA具有良好的对抗脑缺血再灌注损伤的作用。重要的是GA的这些神经保护作用可能与其保护线粒体功能密切相关,与模型组相比,GA可显著性抑制Na_2S_2O_4所致的线粒体膜电位下降、ATP含量以及耗氧量的减少、细胞总ROS水平以及线粒体ROS的增加,这些结果表明GA具有对抗缺血性脑中风的作用,且与其保护神经细胞线粒体功能密切相关。在第二部分中,本研究组发现GA保护线粒体对抗缺氧损伤与其作用mPTP,提高线粒体钙阈值水平有关。与对照组相比,500μmol/L H_2O_2作用后,细胞内Calcein AM水平下降,膜电位水平降低,Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表达水平升高,Cyt C释放增加表明SH-SY5Y细胞mPTP开放。预作用GA后可显著性逆转H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞mPTP开放,促进细胞的存活,抑制其细胞凋亡的发生。离体小鼠肝脏线粒体钙摄取能力试验结果显示,与对照组相比,GA作用后线粒体钙摄取能力显著性升高,以上结果证明mPTP是GA保护线粒体功能的靶点之一。在第三部分中,本研究组发现,与对照组相比,GA作用后CypD氨基脯氨酸顺反异构酶活性显著性升高,而在离体小鼠肝脏线粒体中Cy PD-ANT-1复合物水平显著下降。有趣的是,在EGF诱导以及MCAO损伤刺激条件下,伴随着ERK磷酸化水平的升高,SH-SY5Y细胞中CypD表达水平显著性下降,且采用U0126抑制ERK磷酸化后,GA对抗H_2O_2诱导的mPTP开放以及MCAO诱导的脑缺血损伤效应均被逆转,与单用GA组相比,联合GA和U0126组细胞内Calcein AM水平显著性下降,Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表达水平升高,脑梗死体积显著性升高。这些结果表明GA一方面直接影响CypD氨基脯氨酸顺反异构酶活性,抑制其于ANT-1结合,另一方面通过作用ERK磷酸化水平,反向抑制CypD的表达,提高mPTP的开放阈值,发挥其神经保护作用。结论:GA通过直接影响CypD与ANT-1结合及影响ERK磷酸化水平,抑制CypD表达,提高线粒体mPTP开放阈值,有效对抗缺血性脑中风病理过程中神经细胞损伤。鉴于mPTP在多种氧化应激损伤过程中的关键作用,GA可能成为该类疾病的潜在治疗药物,其成药性值得进一步研究。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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