抗人TK1单克隆抗体的制备及化学发光检测方法的初步建立

发布时间：2020-04-01 07:27

【摘要】：目的:胸苷激酶1(thymidine kinase 1,TK1)是细胞增殖标记物,可用于肿瘤患者的早期筛查、治疗监测、预后判断等。在近十年里,多个实验室制备了不同的抗TK1抗体用于肿瘤疾病的检测和预后,但灵敏度较低,不能满足临床需要。本研究主要目的为研制可用于临床的TK1抗体,建立化学发光检测方法,为不同类型肿瘤的研究及临床应用提供物质和技术支撑。方法:1.合成目的基因经PCR扩增、Xho I/Eco RI双酶切、与表达载体p ET32a连接、转化至感受态细胞,制备BL21-p ET32a-TK1重组菌,并对重组质粒进行双酶切鉴定。2.采用IPTG诱导BL21-p ET32a-TK1重组菌表达TK1蛋白,并从IPTG作用浓度、培养温度和时间三个因素进行优化,用镍离子亲和层析纯化表达产物,获得TK1重组蛋白,通过SDS-PAGE检测目的蛋白纯度,western blot检测目的蛋白抗原性。3.用上述获得的TK1重组蛋白免疫小鼠,选用免疫效果最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合,筛选出能稳定分泌特异性抗体的单克隆细胞株。通过小鼠腹腔诱生法制备单抗,用正辛酸-硫酸铵沉淀和亲和层析纯化腹水,并对纯化后的单克隆抗体进行纯度、亚型及特异性鉴定。4.筛选配对抗体,确定最佳反应体系,以及该检测方法的线性范围,并进行功能性检测,初步建立化学发光检测方法。结果:1.获得BL21-p ET32a-TK1重组菌。2.在37℃条件下,IPTG浓度为0.2 m M,诱导6 h时重组蛋白TK1表达量最高且为可溶性表达。镍离子亲和层析梯度洗脱在80 m M咪唑条件下TK1重组蛋白纯度最大,经western blot检测蛋白具有抗原性。3.通过ELISA间接法,筛选出8株Ig G1亚型、且特异性高的抗TK1单克隆细胞株,并制备8株单克隆抗体,经SDS-PAGE检测所得抗体纯度均大于95%。4.获得1对可用于TK1化学发光检测方法的配对抗体:包被抗体4G3和酶标抗体5E3。经优化包被及酶标条件,最佳检测体系为:4G3每孔包被200 ng,酶标抗体5E3 1:2000稀释。利用此检测条件,检测线性范围可达到100-5000pg/m L。结论:利用基因工程技术,杂交瘤技术制备出8株TK1单克隆抗体,并筛选出一对配对抗体,应用该配对抗体,初步建立TK1化学发光检测方法。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.43

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