ANXA11沉默影响慢性粒细胞白血病K562细胞恶性行为及分子机制研究

发布时间：2017-03-24 01:00

  本文关键词：ANXA11沉默影响慢性粒细胞白血病K562细胞恶性行为及分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一种造血干细胞异常克隆的恶性肿瘤,大约占所有癌症的0.3%,占成人白血病的20%,95%的CML病例呈BCR-ABL阳性。BCR-ABL融合基因由9号和22号染色体易位形成,编码原癌蛋白BCR-ABL,该蛋白具持续激活的酪氨酸激酶活性,BCR-ABL酪氨酸激酶可激活下游信号通路促进细胞持续增殖、增强细胞迁移、干扰细胞正常凋亡、阻断细胞分化,最终引发CML。ANXA11(Annexin A11,膜联蛋白A11)为膜联蛋白家族一员,是Ca2+依赖性膜结合蛋白,广泛表达于除酵母以外的真核细胞中。研究表明ANXA11表达失调与多种肿瘤恶性转变、耐药性及转移等密切相关,但与白血病的关系鲜有报道。目的:1、构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11表达载体,稳定转染至K562细胞,筛选得到ANXA11表达稳定下调的K562单克隆细胞株;2、研究ANXA11下调对K562细胞生物学行为的影响;3、探究ANXA11调控K562细胞生物行为相关分子机制。方法:1、根据人源ANXA11的mRNA序列,设计针对其特异的shRNA及无关序列作为阴性对照,并构建到p GPU6/GFP/Neo表达载体中;2、利用Lipofetamin 2000转染试剂,将构建好的表达载体转染至K562细胞,G418筛选及有限稀释法得到相应单克隆细胞株,采用qPCR和Western blot方法检测稳定下调表达ANXA11的K562单克隆细胞株;3、倒置显微镜观察ANXA11沉默对K562细胞形态的影响;4、CCK-8检测ANXA11沉默对K562细胞体外增殖能力的影响;5、甲基纤维素集落实验检测ANXA11沉默对K562细胞体外克隆形成能力的影响;6、Transwell检测ANXA11沉默对K562细胞体外迁移、侵袭能力的影响;7、qPCR、Western blot分析ANXA11下调对K562细胞中相关分子表达的影响。结果:1、筛选得到稳定下调表达ANXA11的K562单克隆细胞株(K562-shANXA11)及无关序列单克隆细胞株(K562-shNC)。与K562-shNC细胞相比,K562-shANXA11中ANXA11在mRNA和蛋白水平分别下调了94%和95%;2、K562-shANXA11较K562-shNC细胞增殖明显受到抑制;3、K562-shANXA11较K562-shNC细胞克隆形成数下降了45%;4、K562-shANXA11较K562-shNC细胞迁移和侵袭细胞数分别减少了36%和43%;5、K562-shANXA11较K562-shNC细胞形态变大,且K562-shANXA11细胞中巨核细胞表面标记分子CD61表达明显上调(2.27倍);6、ANXA11沉默抑制了STAT5b、Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-6、FAK、MMP-2的表达及STAT5和FAK磷酸化;ANXA11沉默上调了MEK1/2、ERK2磷酸化及Elk1和TIMP-1的表达。结论:1、成功获得稳定下调表达ANXA11的K562单克隆细胞株K562-shANXA11;2、ANXA11沉默明显抑制K562细胞的体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;3、ANXA11沉默诱导K562细胞向巨核细胞分化;4、ANXA11沉默可通过抑制STAT5相关的信号通路调控K562细胞增殖、克隆形成;ANXA11沉默可通过抑制FAK相关的信号通路调控K562细胞迁移、侵袭。另外,ANXA11沉默可能通过激活MEK/ERK2/ElK1通路诱导K562细胞向巨核细胞分化。
【关键词】：膜联蛋白 A11 K562 细胞 FAK STAT5 MEK/ERK2
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.72
【目录】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-13
• 前言13-14
• 第一部分 ANXA11表达稳定下调的K562细胞株的建立14-30
• 材料和方法14-21
• 1.材料14-16
• 1.1 细胞株14
• 1.2 引物和载体14
• 1.3 主要仪器及试剂14-16
• 2.方法16-20
• 2.1 载体构建及验证16-17
• 2.2 ANXA11表达稳定下调的K562细胞的建立17-20
• 3.统计学分析20-21
• 结果21-25
• 1.表达载体构建及验证21-22
• 2. pGPU6/GFP/Neo真核表达载体转染K562细胞22-23
• 3. qPCR检测单克隆细胞ANXA11 mRNA水平23-24
• 4. Western blot检测单克隆细胞株ANXA11蛋白水平24-25
• 讨论25-27
• 结论27-28
• 参考文献28-30
• 第二部分 ANXA11沉默对K562细胞增殖、克隆形成、迁移侵袭、分化及相关信号分子的影响30-49
• 材料和方法30-35
• 1.材料30-32
• 1.1 细胞系30
• 1.2 主要仪器及试剂30-32
• 2.方法32-35
• 2.1 ANXA11沉默对K562细胞增殖能力的影响32
• 2.2 ANXA11沉默对K562细胞克隆形成能力的影响32
• 2.3 ANXA11 沉默对 K562 细胞迁移能力的影响32-33
• 2.4 ANXA11 沉默对 K562 细胞侵袭能力的影响33
• 2.5 ANXA11 沉默对 K562 细胞分化的影响33-34
• 2.6 q PCR检测相关分子34
• 2.7 Western blot 检测相关分子34-35
• 2.8 统计学分析35
• 结果35-42
• 1. ANXA11沉默抑制K562细胞体外增殖能力35-36
• 2. ANXA11 沉默抑制 K562 细胞克隆形成能力36-37
• 3. ANXA11沉默抑制K562细胞体外迁移能力37-38
• 4. ANXA11沉默抑制K562细胞体外侵袭能力38-39
• 5. ANXA11沉默诱导K562细胞向巨核细胞分化39
• 6. ANXA11沉默抑制STAT5b表达及STAT5活性39-40
• 7. ANXA11 沉默抑制抗凋亡蛋白表达40
• 8. ANXA11沉默影响迁移、侵袭相关分子的表达40-41
• 9. ANXA11 沉默增强 MEK/ERK2/El K1 信号活性41-42
• 讨论42-45
• 结论45-46
• 参考文献46-49
• 综述49-61
• 参考文献56-61
• 致谢61-62

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  本文关键词：ANXA11沉默影响慢性粒细胞白血病K562细胞恶性行为及分子机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

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