HMGB1修饰纳米纤维支架对间充质干细胞成骨分化和骨修复的影响

发布时间：2017-04-04 13:11

  本文关键词：HMGB1修饰纳米纤维支架对间充质干细胞成骨分化和骨修复的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：骨是高度血管化的组织,血管新生在骨发育和骨缺损的修复中起重要的作用,大段骨缺损修复仍然是骨科中一个具有挑战性的课题。目前,临床治疗大段骨缺损的主要方法是自体移植和/或异体移植,而这两种方法都无法诱导血管新生,并存在着来源不足、供体部位损伤、潜在的疾病可能性或排斥反应等缺陷。骨组织工程支架虽然能够避免这些缺陷,但这些支架在应用中往往同样缺乏足够血管新生和血液供给,易导致氧气和营养物质供给不足甚至细胞死亡,影响修复效果甚至导致修复失败。支架移植入骨组织后,炎症反应会引起由周围组织向材料内部的血管生长和干细胞诱导的血管新生。在细胞损伤后,促炎症因子高迁移率族蛋白B 1(High-mobility group box 1,HMGB 1)作为组织损伤的第一批信号之一从坏死细胞中被动释放,参与炎症反应、组织损伤和再生的过程。HMGB 1能作为一种多功能信号因子引起细胞响应,包括促进多种干细胞迁移、促进骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)向成骨方向分化等,因此推测HMGB 1有骨诱导能力。HMGB 1还能够促进心肌和血管生成干/祖细胞(Cardiac and angiogenic stem/progenitor cells)的分化,因此HMGB 1也可能是强促血管新生因子。本研究拟利用HMGB 1制备同时具有骨诱导能力和促血管新生能力的骨组织工程支架,以促进骨缺损的修复。将HMGB 1作为信号分子通过肝素修饰在静电纺丝纳米纤维支架上,制备成生物活性纳米纤维骨组织工程支架,并研究其对成骨分化和血管新生的影响,以及对骨缺损修复的影响。本文主要研究内容及结论如下:①原代大鼠骨髓MSCs的分离培养和鉴定。提取的原代大鼠MSCs具有成纤维样细胞形态、粘附能力和增殖潜力较强。三向分化实验证明MSCs能够向骨、软骨和脂肪细胞分化。②制备和表征HMGB 1修饰骨组织工程支架。成功制备了具有良好多孔结构、内部连通、力学性能且能够模拟细胞外基质的纳米纤维支架。成功利用肝素分子修饰HMGB 1至纳米纤维表面。HMGB 1在支架上分布均匀,释放缓慢。③体外研究HMGB 1修饰骨组织工程支架对MSCs影响。体外实验表明HMGB 1修饰骨组织工程支架在7天时对MSCs增殖没有影响;在14天时对MSCs存活没有影响,没有细胞毒性;能够促进MSCs的粘附;使MSCs形态更细长并呈各向异性分布;可诱导MSCs向成骨方向分化。④利用大鼠皮下埋植模型考察HMGB 1修饰骨组织工程支架对细胞浸润、成骨修修复和血管新生的影响。HE实验表明HMGB 1修饰骨组织工程支架支架有细胞浸润,生物相容性良好。CD31与CD34染色表明支架能够促进血管新生;对骨钙素(Osteocalcin,OCN)进行染色发现支架能够促进成骨分化。进一步发现HMGB 1修饰骨组织工程支架能够通过上调间质细胞来源的因子1(Stromal cell-derived factor 1,SDF 1)的表达招募MSCs向支架内部迁移。CD68染色发现该支架并没有引起额外的炎症反应,安全性好。⑤利用大鼠颅骨缺损模型研究HMGB 1修饰骨组织工程支架对大块骨缺损修复的影响以及成骨分化和微血管新生的情况。HE染色证明HMGB 1修饰骨组织工程支架能够显著促进骨缺损的修复质量和修复速度。CD34免疫荧光染色和OCN免疫组化证明,HMGB 1修饰骨组织工程支架在骨环境中有促成骨分化和血管新生能力。综上所述,本研究利用HMGB 1作为组织工程信号分子,成功制备了一种骨组织工程支架,可同时实现促进血管新生、诱导成骨分化、招募干细胞,以提升骨缺损的修复效果。
【关键词】：骨组织工程 高迁移率族蛋白B1 血管新生 骨修复 间充质干细胞
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 摘要3-5
• 英文摘要5-12
• 1 绪论12-20
• 1.1 问题的提出及研究意义12-17
• 1.1.1 问题的提出12-17
• 1.1.2 研究意义17
• 1.2 本文研究目的和研究内容17-20
• 1.2.1 本文研究目的17-18
• 1.2.2 本文研究的主要内容18
• 1.2.3 本文研究的主要创新点18-20
• 2 MSCS分离、培养和多向分化潜能的鉴定20-30
• 2.1 引言20-22
• 2.2 材料与试剂22-23
• 2.2.1 实验动物22
• 2.2.2 实验仪器及耗材22
• 2.2.3 实验试剂22-23
• 2.2.4 主要试剂的配制23
• 2.3 实验方法23-25
• 2.3.1 全骨髓贴壁法分离提取原代大鼠骨髓MSCs23-24
• 2.3.2 MSCs的培养、纯化和传代24
• 2.3.3 MSCs多向分化潜能的鉴定24-25
• 2.4 实验结果25-27
• 2.4.1 MSCs分离和培养25-26
• 2.4.2 MSCs多向分化潜能的鉴定26-27
• 2.5 讨论与分析27-28
• 2.6 本章小结28-30
• 3 制备和表征HMGB 1 修饰PLLA/PCL纳米纤维骨组织工程支架30-42
• 3.1 引言30-32
• 3.2 材料与试剂32-33
• 3.2.1 实验仪器与耗材32-33
• 3.2.2 实验试剂33
• 3.2.3 主要试剂的配制33
• 3.3 实验方法33-35
• 3.3.1 静电纺丝纳米纤维薄膜的制备33-34
• 3.3.2 扫描电子显微镜(Scanning electron microscopy, SEM)表征34
• 3.3.3 纳米纤维薄膜的力学性能测试34
• 3.3.4 HMGB 1 修饰纳米纤维支架的制备34-35
• 3.3.5 HMGB 1 修饰纳米纤维支架的表征35
• 3.4 实验结果35-39
• 3.4.1 静电纺丝纳米纤维薄膜的制备35
• 3.4.2 SEM表征结果35-36
• 3.4.3 纳米纤维薄膜的力学性能测试36-37
• 3.4.4 HMGB 1 修饰纳米纤维支架的制备和表征37-39
• 3.5 讨论与分析39
• 3.6 本章小结39-42
• 4 体外研究HMGB 1 修饰骨组织工程支架对MSCS的影响42-60
• 4.1 引言42
• 4.2 材料与试剂42-43
• 4.2.1 实验仪器及耗材42
• 4.2.2 实验试剂42-43
• 4.2.3 主要试剂的配制43
• 4.3 实验方法43-47
• 4.3.1 实验分组43
• 4.3.2 MTS测量细胞增殖43
• 4.3.3 Calcein AM/PI检测细胞存活43-44
• 4.3.4 MSCs粘附和细胞形态44-45
• 4.3.5 实时定量PCR (qRT-PCR)检测不同支架对MSCs分化的影响45-46
• 4.3.6 不同支架对MSCs的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)表达的影响46
• 4.3.7 茜素红S染色检测不同支架对MSCs钙结节的影响46-47
• 4.4 实验结果47-58
• 4.4.1 MTS测量细胞增殖47-48
• 4.4.2 Calcein AM/PI检测细胞存活48-50
• 4.4.3 MSCs粘附和细胞形态50
• 4.4.4 实时定量PCR (qRT-PCR)检测不同支架对MSCs分化的影响50-51
• 4.4.5 不同支架对MSCs的ALP表达的影响51-54
• 4.4.6 不同支架对MSCs钙结节的影响54-58
• 4.5 讨讨论与分析58-59
• 4.6 本章小结59-60
• 5 HMGB 1 修饰骨组织工程支架对成骨分化和血管新生的影响60-78
• 5.1 引言60
• 5.2 材料与试剂60-61
• 5.2.1 实验动物60
• 5.2.2 实验仪器及耗材60
• 5.2.3 实验试剂60-61
• 5.2.4 主要试剂的配制61
• 5.3 实验方法61-63
• 5.3.1 皮下埋植实验材料61
• 5.3.2 皮下埋植实验61
• 5.3.3 石蜡切片61-62
• 5.3.4 冰冻切片62
• 5.3.5 免疫荧光染色62
• 5.3.6 HE染色62
• 5.3.7 免疫组织化学染色62-63
• 5.4 实验结果63-75
• 5.4.1 一般观察63
• 5.4.2 HE染色结果63-64
• 5.4.3 不同支架材料在体促成骨分化能力研究64-66
• 5.4.4 在体研究不同支架材料对微血管血管新生的影响研究66-69
• 5.4.5 在体研究不同支架材料对MSCs的招募作用69-72
• 5.4.6 在体研究不同支架材料对MSCs的招募作用的原理72-74
• 5.4.7 不同支架材料在皮下的炎症响应情况74-75
• 5.5 讨论与分析75-76
• 5.6 本章小结76-78
• 6 HMGB 1 修饰骨组织工程支架在大鼠颅骨缺损模型中的修复效果78-88
• 6.1 引言78
• 6.2 材料与试剂78-79
• 6.2.1 实验动物78
• 6.2.2 实验仪器及耗材78
• 6.2.3 实验试剂78-79
• 6.2.4 主要试剂的配制79
• 6.3 实验方法79
• 6.3.1 颅骨缺损修复实验材料79
• 6.3.2 大鼠颅骨缺损修复实验79
• 6.3.3 切片、HE染色、免疫荧光以及免疫组织化学79
• 6.4 实验结果79-85
• 6.4.1 HE染色79-81
• 6.4.2 OCN免疫组织化学染色81-82
• 6.4.3 CD34免疫荧光染色82-85
• 6.5 讨论与分析85
• 6.6 本章小结85-88
• 7 结论与展望88-90
• 7.1 本文主要结论88-89
• 7.2 后续研究工作展望89-90
• 致谢90-92
• 参考文献92-100
• 附录100
• A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录100
• B. 作者在攻读学位期间取得的科研成果目录100

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