【目的】近年来,非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic Steatohepatitis,NASH)患病率增长迅速,其中有20%的NASH患者会发展为肝硬化。研究表明NLRP3炎症小体(NLRP3 Inflammasome)激活后通过释放炎症因子参与炎症并可诱发NASH。去脂软肝方为云南省荣誉名中医肝病专家苏涟教授经验有效方,前期临床及实验研究表明该方具有降脂及防治NASH的作用,然而去脂软肝方防治NASH的作用机制是否与抑制NLRP3炎症小体及相关因子有关尚不清楚。本研究旨在从NLRP3炎症小体的角度观察去脂软肝方防治NASH的作用及可能机制,为该方的临床应用提供理论依据,丰富中医药治疗NASH的科学内涵。【方法】1.根据随机数字表法,将SPF级SD雄性大鼠随机分为六组,分别为正常组,模型组、去脂软肝方低剂量组、去脂软肝方中剂量组、去脂软肝方高剂量组、辛伐他汀组。复制非酒精性脂肪性肝炎的大鼠模型,在第一天造模的同时给予药物干预,去脂软肝方低、中、高剂量组给药量分别为7.11g/kg/d,14.22g/kg/d,28.44g/kg/d,辛伐他汀组给药量为1.8mg/kg/d,正常组与模型组予2ml生理盐水灌胃,分别在第8周末和第14周末取材,以备指标检测。2.观察去脂软肝方对NASH的防治作用。在第8周末及第14周末两个时间点,采用HE染色和油红O染色观察各组大鼠肝脏病理形态学的变化情况;采用比色法检测大鼠血清肝功能指标(ALT、AST)的变化情况;采用酶法检测血清中血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)的变化情况;采用GPO-PAP法检测大鼠肝脂(TC、TG)的变化情况。3.观察去脂软肝方对NLRP3炎症小体及相关因子表达的影响。在14周末采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组大鼠肝脏中NLRP3mRNA、ASCmRNA、Caspase-1 mRNA的表达;采用免疫组化二步法检测各组大鼠肝脏NLRP3、Caspase-1蛋白的表达;采用酶联免疫吸附法(Elisa)检测肝脏炎性因子IL-1β和IL-18的含量。【结果】1.去脂软肝方可减轻NAFL进展为NASH模型大鼠病理形态学改变。HE染色结果发现,与正常组相比,第8周末时,模型组大鼠肝细胞排列紊乱,肝索分辨不清,出现大量脂肪空泡或伴有轻度的胞浆疏松化改变,表明NAFL模型复制成功;到14周末时,模型组大鼠肝脏脂质沉积面积增大,脂质空泡增多、明显胞浆疏松化、气球样变及少量炎性细胞浸润,表明NASH模型成功复制,而去脂软肝方各剂量组与辛伐他汀组脂肪空泡均有所减少,胞浆疏松化、气球样变及炎性细胞浸润均减轻,其中去脂软肝方高剂量组和辛伐他汀组较为显著。油红O结果显示第8周末和第14周末模型组大鼠肝脏均出现大量圆形橙红色脂滴空泡,去脂软肝方各剂量组与辛伐他汀组橙红色脂滴均减少。2.去脂软肝方可降低NAFL进展为NASH模型大鼠肝指数、血脂、肝脂及改善肝功能。第8周末和第14周末,与正常组对比,模型组大鼠肝指数、血脂指标(TC、TG、LDL-C)、肝脂(TC、TG)、肝功能指标(ALT、AST)持续升高,差异显著(P0.05)。与模型组相比,去脂软肝方中、高剂量组及辛伐他汀组均降低,差异显著(P0.05),去脂软肝方低剂量组血脂及肝脂TG呈下降趋势,差异不显著(P0.05),去脂软肝方各剂量组与辛伐他汀组HDL-C均升高,差异显著(P0.05)。3.去脂软肝方可降低NASH大鼠肝脏NLRP3mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA的表达水平。在第14周末,与正常组相比,模型组大鼠肝脏NLRP3mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA相对表达量均升高,差异显著(P0.05)。与模型组相比,去脂软肝方各剂量组与辛伐他汀组NLRP3mRNA相对表达量均降低,差异显著(P0.01),去脂软肝方中、高剂量组ASCmRNA、Caspase-1 mRNA相对表达量均降低,差异显著(P0.01),去脂软肝方低剂量、辛伐他汀组ASCmRNA、Caspase-1 mRNA相对表达量呈下降趋势,差异不显著(P0.05)。4.去脂软肝方可降低NASH大鼠肝脏NLRP3、Caspase-1蛋白的表达水平。在第14周末,与正常组相比,模型组大鼠肝细胞胞浆可见NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白的阳性表达增多,其IOD/AREA值也明显增高,差异显著(P0.05)。与模型组相比,去脂软肝方各剂量组与辛伐他汀组肝细胞内NLRP3蛋白的阳性表达明显减少,其IOD/AREA值也明显降低,差异显著(P0.01);去脂软肝方中、高剂量组肝细胞内Caspase-1蛋白的阳性表达明显减少,其IOD/AREA值也明显降低,差异显著(P0.05),去脂软肝方低剂量组与辛伐他汀组Caspase-1蛋白的阳性表达具有下降趋势,差异不显著(P0.05)。5.去脂软肝方可降低NASH大鼠肝脏IL-1β和IL-18的表达。在第14周末,与正常组相比,模型组大鼠肝脏IL-1β、IL-18的相对表达量均升高,差异显著(P0.01)。与模型组相比,去脂软肝方中、高剂量组与辛伐他汀组IL-1β相对表达量均降低,差异显著(P0.01),去脂软肝方低剂量IL-1β相对表达量呈下降趋势,差异不显著(P0.05);去脂软肝方中、高剂量组IL-18相对表达量均降低,差异显著(P0.01),去脂软肝方低剂量、辛伐他汀组IL-18相对表达量呈下降趋势,差异不显著(P0.05)。【结论】1.从NAFL进展为NASH的病程中,NLRP3炎症小体及相关因子表达升高。2.去脂软肝方可降低NASH模型大鼠NLRP3炎症小体及相关因子的表达,减轻脂肪变性和炎性病变。
【学位单位】：云南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
第8周末各组大鼠HE染色结果（10×40）
第14周末各组大鼠HE染色结果（10×40）
第8周末各组大鼠油红O染色结果（10×40）
【参考文献】
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2861918
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