Ihh信号通路在咬合升高致TMJOA髁突软骨中的表达变化及作用机制研究

发布时间：2020-10-31 07:47

　　 目的:本研究目的是观察India Hedgehog(Ihh)信号在咬合升高诱发颞下颌关节骨关节炎(Temporomandibular joint osteoarthritis,TMJOA)中的表达情况,从而探讨Ihh信号在TMJOA发生进展中作用及机制。方法:随机地将48只年龄为八周的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠等量地分为实验组和对照组。实验组采用“三明治夹心饼干法”建立SD大鼠双侧后牙的咬合升高模型以诱导大鼠产生TMJOA,而对照组除咬合升高外,其余操作步骤均与实验组相同。选择在咬合升高后的第3、7、14和28天,分别处死实验组及对照组的大鼠,每组各6只。通过苏木精-伊红和番红O固绿染色观察各组大鼠髁突软骨的组织学改变,并使用改进的Mankin,s评分系统来评估其髁突软骨的损伤程度。使用ELISA试剂盒检测各个组别大鼠血清内Ihh的表达变化,应用免疫组织化学染色检测髁突软骨组织内Ihh信号相关分子(包括印度刺猬蛋白(Ihh),平滑蛋白(Smo)和Gli锌指转录因子-1(Gli-1))、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(Caspase-3)的蛋白表达。采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)以进一步分析髁突软骨中Ihh信号相关分子、MMP-13和Caspase-3的基因表达。结果:组织学分析显示所有实验组大鼠的髁突软骨均出现骨关节炎样的结构改变,同时番红O固绿染色显示不同实验组大鼠的Mankin,s评分从5.98±0.74增加到8.58±0.63,说明随着咬合升高的时间延长,TMJOA的症状逐渐恶化。然而观察各个时间段的对照组大鼠髁突软骨,发现在组织形态学染色上没有明显的异常改变。免疫组化及RT-PCR的结果显示实验组中Ihh,Smo和Gli-1被激活,且其表达水平在咬合升高的早期阶段显著增加,而对照组Ihh信号的相关因子表达没有出现明显的波动。与对照组相比,实验组软骨细胞肥大标志物(MMP-13)和凋亡标志物(Caspase-3)的表达变化呈时间相关性,并对各个时间段的因子进行比较,差异是具有统计学意义的(P0.05)。实验组与对照组大鼠只有在咬合升高后第七天,其血清内Ihh表达比较才具有统计学意义。结论:我们的数据表明,“三明治夹心饼干法”是建立SD大鼠TMJOA模型的成功方法。在TMJOA发生发展中,Ihh信号通路在髁突软骨损伤中发挥重要的调控作用,而且其激活与髁突软骨细胞的肥大密切有关。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R782.6
【部分图文】：

山西医科大学硕士学位论文8第二步——口内手术：牙齿表面经过清洁处理后，将标准尺寸的铝片置于口腔的上颌后牙列。将3M流动树脂注入铝片围墙中，光固化以形成咬合垫。以形成上颌后牙的第一磨牙的咬合垫高度为1.5mm、第三磨牙的咬合垫高度为1mm的楔形咬合升高模型。第三步——修整边缘：切下铝板的多余部分，并使用特殊的正畸蓝胶封闭锐利的边缘（图1A）。图1A“三明治”咬合升高的具体步骤（3）动物处置咬合升高后的第3、7、14和28天，进行腹主动脉采血，离心后得到血清。随后用过量的水合氯醛杀死大鼠。取出大鼠的双侧髁突组织，将左侧髁突组织固定于多聚甲醛中，进行切片制作；将右侧髁突组织暂时保存在-80℃液氮中，随后进行基因检测。1.2.2大鼠血清Ihh的ELISA检测（1）六个标准品的配制：按照实验说明书的步骤对试剂盒内的标准品进行梯度稀释，随后开始配置六个标准品。（2）进行孔板设置及加样：分别设置三种孔板：标准品孔、空白样品孔及待测样品孔。待测样品孔的加样方法是每孔先加入40ul的样品稀释液，再加10ul的待测样品；标准品孔则需在酶标板内准确加样配置好的各种标准品，每孔50ul；空白样品孔中除了不加酶标试剂及待测样品以外，其余每步的操作步骤与其他两种孔板相同。（3）加酶：各孔加入100ul的酶试剂。（4）温育：使用封板膜进行小心地封板，将铺板置于37℃的恒温水浴箱内，开始计时30分钟的温育。（5）洗涤：小心地揭掉封板膜，垂直倒向地弃去孔板内的液体并拍干残液，随

山西医科大学硕士学位论文15运用单因素方差分析对组间的数据进行比较，将实验组咬合升高第三天与咬合升高第七天相比，以及实验组咬合升高第三天与咬合升高第十四天相比，发现各组间血清Ihh浓度的差异具有统计学意义（P<0.05）。而且，实验组咬合升高第七天血清内Ihh浓度与咬合升高第二十八天相比，以及实验组咬合升高第十四天血清内Ihh浓度与咬合升高第二十八天相比，差异都是具有统计学的意义（P<0.05）（表3）。表3Elisa检测出各组别血清中的Ihh浓度组别Ihh的血清浓度（ng/ml）n对照组第三天0.18±0.026实验组第三天0.19±0.01**#6对照组第七天0.19±0.026实验组第七天0.23±0.02****6对照组第十四天0.21±0.036实验组第十四天0.22±0.03***6对照组第二十八天0.18±0.026实验组第二十八天0.19±0.016总计48*:与对照组比较,P<0.05**:与实验组第七天比较,P<0.05#:与实验组第十四天比较,P<0.05***:与实验组第二十八天比较,P<0.05图2ELISA检测各组别血清内Ihh的浓度（ng/ml）

山西医科大学硕士学位论文16*:与对照组比较,P<0.05**:与实验组第七天比较,P<0.05#:与实验组第十四天比较,P<0.05***:与实验组第二十八天比较,P<0.052.3实验组大鼠与对照组大鼠TMJ髁突软骨的形态学比较形态学染色表明，实验组髁突软骨变性的严重程度与咬合升高发生的时间密切相关。但是在不同时间段的HE或番红O固绿染色中，对照组间的组织学切片均没有发现可检测到的差异，故我们随机选择对照组第三天、七天、十四天或第二十八天的一张切片进行图像采集。2.3.1实验组大鼠与对照组大鼠TMJ髁突软骨的HE染色比较HE染色结果显示，大鼠的髁突软骨由外向内依次可分为纤维层，增殖层，肥大层和软骨内骨化层。咬合升高三天的实验组切片显示出软骨细胞的簇集现象。之后，实验组的软骨层结构更加紊乱，细胞萎缩，细胞核被密集染色。增殖层中的软骨细胞出现排列紊乱，甚至一些细胞的核仁呈现完全消失。此外，软骨空腔增加，留下空白阴影，提示出现早期的骨关节炎软骨病变（图3）。图3咬合升高后不同时间段的髁突软骨HE染色A，B，C，D和E分别代表对照组、实验组第3天、实验组第7天、实验组第14天和实验组第28天髁突软骨的HE染色图像（×100）2.3.2实验组大鼠与对照组大鼠TMJ髁突软骨的番红O固绿染色比较番红O固绿染色表明，早期实验组髁突软骨的染色较深，中晚期颜色变浅。咬合升高第三天，实验组髁突软骨的肥大层内出现了软骨细胞的聚集。在第七天实验组
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本文编号：2863658