胰腺癌细胞ezrin基因启动子的靶向敲除及生物学功能研究

发布时间：2020-10-31 19:14

　　 目的:鉴定人胰腺癌Panc-1细胞ezrin基因转录调控区,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除ezrin启动子,检测启动子敲除对Panc-1细胞的ezrin基因表达、细胞增殖和迁移的影响。方法:将携带ezrin基因上游片段的报告基因表达载体瞬时转染胰腺癌细胞Panc-1,采用双荧光素酶报告基因检测系统,鉴定ezrin转录调控区。使用在线软件预测ezrin转录调控区的启动子上下游g RNA靶位点,构建基因编辑重组质粒p X458-PL和p X459-PR。将重组质粒以不同的组合方式共转染Panc-1细胞,加入嘌呤霉素初步筛选,针对待敲除序列进行基因组DNA的PCR扩增和亚克隆测序分析,鉴定Panc-1细胞ezrin启动子的靶向敲除。采用RT-q PCR、Western blotting、细胞增殖和划痕实验分别检测靶向敲除启动子的胰腺癌细胞的ezrin基因m RNA和蛋白的表达情况、细胞增殖和迁移能力的变化。结果:荧光素酶报告基因检测结果显示,ezrin基因上游–87/+134片段具有转录激活作用,–1541/–706片段具有转录激活和增强双重作用。测序结果显示,成功构建了靶向ezrin启动子的基因编辑重组质粒。重组质粒共转染至Panc-1细胞,得到ezrin启动子敲除的胰腺癌细胞Panc-1-epd。与未转染基因编辑重组质粒的对照细胞Panc-1相比,敲除启动子的Panc-1-epd细胞,其ezrin基因m RNA和Ezrin蛋白表达均显著下调,细胞增殖及迁移能力均显著受到抑制。结论:靶向敲除ezrin基因启动子的人胰腺癌细胞ezrin基因表达下调,细胞增殖与迁移能力受到抑制。
【学位单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R735.9
【部分图文】：

遵义医科大学硕士学位论文代基强33带，由此可知质粒pX458与pX459已酶切为线性质粒。注：M：Marker10000；1：pX458单酶切；2：pX459单酶切图2质粒pX458与pX459单酶切结果Fig.2SingledigestionresultsofplasmidspX458andpX4592.2.2基因编辑重组质粒的构建及菌液PCR鉴定将ezrin转录调控区gRNA靶位点序列对应的杂交双链DNA（表1）分别与载体pX458和pX459定向连接，构建靶向ezrin启动子上游、携带绿色荧光标记的基因编辑重组质粒pX458-PL1、pX458-PL2和pX458-PL3，以及靶向ezrin启动子下游、携带嘌呤霉素抗性标记的基因编辑重组质粒pX459-PR1、pX459-PR2和pX459-PR3，gRNA靶向位点及拟切割位置见图3，不同组合拟切除片段大小见表17，将6个质粒全部共转染时，有15种可能的组合方式，不同组合拟切除片段的位置和大小不同。注：黄色阴影为ezrin启动子–87/–32序列，下划线为gRNA靶位点序列，箭头指示拟切割位点。红色字体为转录起始位点+1。

遵义医科大学硕士学位论文代基强35注：M为MarkerDL500；泳道1-4：重组质粒pX459-PR1；泳道5-8：重组质粒pX459-PR2；泳道9-12：重组质粒pX459-PR3图5基因编辑重组质粒pX459-PR菌液PCR结果Fig.5PCRresultsofrecombinantplasmidpX459-PRgene2.2.3基因编辑重组质粒测序验证基因编辑重组质粒测序结果（图6）显示，ezrin启动子区gRNA靶位点序列PL和PR分别与载体pX458和pX459定向连接，靶向ezrin启动子的基因编辑重组质粒pX458-PL1、pX458-PL2、pX458-PL3、pX459-PR1、pX459-PR2和pX459-PR3构建成功。注：黑色方框分别为PL1、PL2、PL3靶序列；红色方框分别为PR1、PR2、PR3靶序列图6ezrin启动子区基因编辑重组质粒的测序鉴定Fig.6Sequencingandidentificationofezrinpromotergeneeditingrecombinantplasmid2.3基因编辑重组质粒共转染胰腺癌Panc-1细胞基因编辑重组质粒pX458-PL1/pX459-PR1、pX458-PL2/pX459-PR2、pX458-PL3/pX459-PR3和pX458-PL1/pX458-PL2/pX458-PL3/pX459-PR1/pX459-PR2/pX459-PR3分别共转染Panc-1细胞，转染24h后，在荧光显微镜下观察到部分细胞显示绿色荧光（图7），表明携带绿色荧光标记的质粒pX458-PL成功进入Panc-1细胞，推测与之有着相似结构的pX459-PR也能

遵义医科大学硕士学位论文代基强35注：M为MarkerDL500；泳道1-4：重组质粒pX459-PR1；泳道5-8：重组质粒pX459-PR2；泳道9-12：重组质粒pX459-PR3图5基因编辑重组质粒pX459-PR菌液PCR结果Fig.5PCRresultsofrecombinantplasmidpX459-PRgene2.2.3基因编辑重组质粒测序验证基因编辑重组质粒测序结果（图6）显示，ezrin启动子区gRNA靶位点序列PL和PR分别与载体pX458和pX459定向连接，靶向ezrin启动子的基因编辑重组质粒pX458-PL1、pX458-PL2、pX458-PL3、pX459-PR1、pX459-PR2和pX459-PR3构建成功。注：黑色方框分别为PL1、PL2、PL3靶序列；红色方框分别为PR1、PR2、PR3靶序列图6ezrin启动子区基因编辑重组质粒的测序鉴定Fig.6Sequencingandidentificationofezrinpromotergeneeditingrecombinantplasmid2.3基因编辑重组质粒共转染胰腺癌Panc-1细胞基因编辑重组质粒pX458-PL1/pX459-PR1、pX458-PL2/pX459-PR2、pX458-PL3/pX459-PR3和pX458-PL1/pX458-PL2/pX458-PL3/pX459-PR1/pX459-PR2/pX459-PR3分别共转染Panc-1细胞，转染24h后，在荧光显微镜下观察到部分细胞显示绿色荧光（图7），表明携带绿色荧光标记的质粒pX458-PL成功进入Panc-1细胞，推测与之有着相似结构的pX459-PR也能
【参考文献】

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本文编号：2864384