沉默XBP1表达增强人骨肉瘤HOS细胞对MPPα-PDT疗法的敏感性

发布时间：2020-11-02 15:20

　　 目的 :研究沉默X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)表达在焦脱镁叶绿酸-α甲酯(pyropheophorbide-αmethylester,MPPα)介导的光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)(MPPα-PDT)处理人骨肉瘤HOS细胞中的作用,并探讨其可能的机制。方法 :MPPα-PDT作用于HOS细胞6、12和24h后,用蛋白质印迹法检测肌醇依赖酶1α(inositol-requiringenzyme1α,IRE1α)-XBP1通路中相关蛋白IRE1α和XBP1的表达水平。采用脂质体转染法将特异性针对XBP 1基因的siRNA转入HOS细胞,然后再行MPPα-PDT处理。实验分为空白对照组、siRNA-阴性对照(negative control,NC)组、siRNAXBP1组、MPPα-PDT组和MPPα-PDT+siRNA-XBP1组,分别用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测各组细胞中XBP1 mRNA和蛋白的表达水平;CCK-8法检测细胞的增殖活性;FCM法检测细胞的凋亡率,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白剪切型-caspase 3(cleaved-caspase 3)和剪切型-聚ADP-核糖聚合酶(cleaved-poly ADP-ribose polymerase,cleavedPARP)的表达水平;最后采用DCFH-DA探针染色法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量以及蛋白质印迹法检测抗氧化相关蛋白过氧化氢酶(Catalase)和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)的表达水平。结果:经MPPα-PDT诱导,HOS细胞中IRE1α和XBP1蛋白的表达水平均上调(P值均0.05)。siRNA-XBP1可抑制HOS细胞中XBP1mRNA和蛋白的表达水平(P值均0.01)。沉默XBP1表达可降低HOS细胞的增殖活性(P 0.05),促进细胞凋亡并上调凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3的表达水平(P 0.05),下调抗氧化相关蛋白Catalase和SOD1的表达水平(P 0.05)。与MPPα-PDT组相比,MPPα-PDT+siRNA-XBP1组细胞增殖活性降低(P 0.01),凋亡率增高(P 0.05),凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3和cleaved-PARP表达水平增高(P值均0.05),细胞内ROS水平上调(P 0.01),抗氧化相关蛋白Catalase和SOD1的表达水平下调(P值均0.01)。结论 :MPPα-PDT可诱导HOS细胞中IRE1α-XBP1通路激活。沉默XBP1表达可抑制HOS细胞的增殖能力并提高其凋亡水平,同时增强HOS细胞对MPPα-PDT的敏感性,其机制可能与上调细胞内ROS水平以及下调抗氧化分子的表达水平相关。
【部分图文】：

CCK-8法检测结果（图3）显示，与空白对照组及si RNA-NC组相比，si RNA-XBP1组HOS细胞的增殖活性随时间延长而下降，且差异具有统计学意义（6、12和24 h各时间点与空白对照组相比，P值均<0.01；与si RNA-NC组相比，P=0.04,P<0.01和P<0.01）；与空白对照组相比，MPPα-PDT组细胞增殖活性明显降低（6、12和24 h时P值均<0.01）；与MPPα-PDT组相比，MPPα-PDT+si RNA-XBP1组细胞增殖活性明显降低（6、12和24 h时P值均<0.01）；空白对照组与si RNA-NC组之间的细胞增殖活性差异无统计学意义（6、12和24 h时P值均>0.05）。这一结果提示，siRNA-XBP1可降低HOS细胞的增殖活性，并且增强MPPα-PDT对细胞增殖活性的抑制作用。图2 分别采用实时荧光定量PCR法（A）和蛋白质印迹法（B）检测转染siRNA-XBP1后人骨肉瘤HOS细胞中XBP1 mRNA和蛋白表达水平以及联合MPPα-PDT处理对XBP1 mRNA和蛋白表达水平的影响

图1 蛋白质印迹法检测MPPα-PDT对人骨肉瘤HOS细胞中IRE1α和XBP1蛋白表达水平的影响图3 CCK-8法检测沉默XBP1表达联合MPPα-PDT对人骨肉瘤HOS细胞增殖活性的影响

图2 分别采用实时荧光定量PCR法（A）和蛋白质印迹法（B）检测转染siRNA-XBP1后人骨肉瘤HOS细胞中XBP1 mRNA和蛋白表达水平以及联合MPPα-PDT处理对XBP1 mRNA和蛋白表达水平的影响2.4 沉默XBP1表达可上调人骨肉瘤HOS细胞的凋亡水平
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