内质网应激和凋亡在砷氟联合致H9c2心肌细胞毒性损伤中的作用

发布时间：2020-11-04 21:15

　　 目的:研究砷氟联合染毒对H9c2心肌细胞毒性作用;探讨内质网应激(ERS)和细胞凋亡在砷氟联合染毒对H9c2心肌细胞损伤中的关系及作用;分析砷氟联合染毒时两者之间的相互作用关系。方法:本实验采用H9c2心肌细胞模型,砷氟单独及联合染毒按不同剂量分为9组:对照组(C组),低砷组(As_(10)组,10μM),高砷组(As_(25)组,25μM),低氟组(F_(10)组,10 mg/L),高氟组(F_(35)组,35mg/L),低砷低氟组[As_(10)F_(10)组,10μM(As)+10 mg/L(F)],低砷高氟组[As_(10)F_(35)组,10μM(As)+35mg/L(F)],高砷低氟组[As_(25)F_(10)组,25μM(As)+10 mg/L(F)],高砷高氟组[As_(25)F_(35)组,25μM(As)+35mg/L(F)]。通过CCK-8法检测砷氟联合染毒后的H9c2心肌细胞存活率;通过流式细胞术检测细胞凋亡率;使用倒置显微镜、光镜和电镜观察细胞形态和超微结构的改变;检测心肌酶AST和CRE的酶活力;通过qRT-PCR法检测心肌细胞中ERS相关基因GRP78、PERK和CHOP的表达情况;通过Western-blot法检测心肌细胞中ERS和凋亡相关蛋白GRP78、PERK、CHOP和Cleaved-caspase-3的表达情况;采用免疫荧光法检测心肌细胞中ERS标志基因GRP78的表达情况。进一步,我们采用ERS抑制剂4-PBA干预后,检测心肌细胞存活率和ERS相关基因GRP78和CHOP的蛋白表达情况。统计方法采用SPSS22.0对实验数据进行单因素方差分析和析因分析。结果:1、存活率和凋亡率的改变:(1)存活率结果显示,不同剂量砷氟染毒12h和24h时,细胞存活率呈上升趋势,并达到最高;48h、72h和96h后,随着时间的延长,细胞存活率呈时间依赖性下降。且染毒24h时各染毒组中存活率比对照组均显著的降低(除As_(10)组和As_(10)F_(10)组外)。(2)凋亡率结果显示,各染毒组早凋率和总凋率比对照组均显著上升。2、心肌细胞形态学的改变:(1)镜下观察:单砷组细胞体积收缩,排列紊乱,密度减小;F_(35)组细胞排列整齐,存在少量变圆的凋亡细胞;联合染毒组细胞相互交联,密度减少,变圆的凋亡细胞明显增加。(2)HE染色:单砷组细胞数量变少,轮廓模糊,核内染色质凝集,坏死细胞数目较多;F_(35)组部分细胞肿大,轮廓模糊,F_(10)组无明显改变;联合染毒组的细胞有不同程度的肿大,间隙变宽,核内染色质凝集,其中As_(25)F_(10)组和As_(25)F_(35)组部分细胞核膜完整性受损,染色质凝集。3、心肌细胞超微结构的改变:(1)细胞核:F_(10)组的细胞核无明显改变,其余各染毒组的细胞核表面有深浅不一的凹陷,核内染色质不同程度的散落在细胞边缘。As_(25)组和F_(35)组以及As_(25)F_(35)联合组的细胞核体积明显缩小。(2)内质网:单砷组细胞的内质网肿胀最严重,扩张呈池状;单氟组细胞的内质网扩张肿胀的数量明显增多且呈泡状;联合组的细胞表现为内质网脱颗粒,核蛋白体脱落、游离,扩张呈泡状或池状的数量明显增多。4、心肌损伤标志物的改变:与对照组相比,砷氟单独染毒组AST和CRE活力显著性增加(除F_(10)组的CRE);砷氟联合染毒组中仅在As_(10)F_(35)组和As_(25)F_(35)组CRE活力显著性增加,但AST活力无显著变化。5、ERS与凋亡相关基因mRNA和蛋白表达情况:(1)mRNA表达:在各染毒组中,CHOP mRNA的表达水平均显著性升高。GRP78 mRNA的表达水平在As_(10)F_(35)组和As_(25)F_(10)组中显著性升高。PERK的mRNA的表达水平在As_(10)F_(35)组、As_(25)F_(10)组和As_(25)F_(35)组中显著性升高。GRP78和PERK的mRNA表达水平在其余染毒组虽然表现出上升趋势,但无统计学差异。(2)蛋白表达:在各染毒组中,GRP78、PERK和CHOP的蛋白表达水平均显著性升高,但As_(25)组的PERK和As_(25)F_(35)组的CHOP无显著差异。Cleaved-casapse3的蛋白表达水平在单砷组无明显变化,而在单氟组显著升高,砷氟联合组仅在As_(10)F_(10)组和As_(10)F_(35)组中显著性升高。(3)免疫荧光ERS标志蛋白GRP78的表达:GRP78的平均荧光强度仅在As_(25)组、F_(35)组、As_(25)F_(10)组和As_(10)F_(35)组中显著性增强。6、抑制剂4-PBA干预砷氟染毒后,细胞存活率以及ERS相关蛋白的表达情况:(1)存活率:与各染毒组相比,抑制剂4-PBA干预后,各染毒组细胞存活率显著升高(除As_(10)组和As_(10)F_(35)组外)。(2)ERS相关蛋白的表达:与染毒组相比,抑制剂4-PBA干预后,GRP78的蛋白表达量均显著下降(除F_(35)组、As_(10)F_(35)组和As_(25)F_(35)组外),而CHOP蛋白表达量均下降,但仅在F_(10)组和As_(25)F_(10)组中显著下降。7、交互作用分析结果显示,砷氟联合染毒对凋亡率的影响中,As_(25)F_(10)组和As_(25)F_(35)组中砷与氟存在协同效应,As_(10)F_(10)组和As_(10)F_(35)组中砷与氟存在拮抗效应。除此之外,砷氟联合染毒对心肌酶(AST和CRE)、内质网应激相关mRNA(GRP78和PERK)和蛋白(GRP78、PERK和CHOP)以及凋亡相关蛋白Cleaved-casapse3的影响中,砷和氟之间主要表现为拮抗效应。结论:1、砷氟联合染毒抑制了H9c2心肌细胞的存活率,改变了心肌细胞形态和超微结构(细胞核和ER),激活了心肌损伤相关酶活力,并诱导细胞发生早期凋亡,最终导致H9c2心肌细胞损伤。2、砷氟联合染毒后,首先激活了GRP78与PERK表达水平,然后启动了ERS早期凋亡因子CHOP,进一步引起了Caspase-3的激活,诱导心肌细胞发生凋亡。因此,我们分析内质网凋亡通路可能参与了砷氟联合染毒致心肌细胞损伤的过程。3、析因分析结果显示,砷氟联合染毒在对心肌损伤、ERS和凋亡影响的过程中,各个指标在砷与氟之间主要表现为拮抗效应。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R114
【部分图文】：

山西医科大学硕士学位论文6基重悬细胞，调整细胞密度，用于后续实验。1.2.3细胞存活率的测定本实验采用CCK-8检测细胞存活率，实验方法如下图所示：图1-1细胞存活率测定方法流程图1.2.4心肌细胞凋亡的测定将细胞悬液以100万个/瓶的密度接种于T25培养瓶中培养24h后。按表1-1分组染毒24h。用不含有EDTA的胰酶消化、吹打，1000r/min离心10min；倒掉上清，PBS洗涤细胞沉淀3次，制成体积为2ml的细胞悬液。收集细胞于试管中，在试管中加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞，在1500r/min下离心5分钟；弃上清液，加入5μL的AnnexinV混匀，再加入5μL的PropidiumIodide混匀后。室温下避光反应20分钟，最后加上250μL的上机液进行检测。1.2.5镜下观察心肌细胞形态的变化按表1-1分组染毒24h，观察镜下细胞形态并拍照。1.2.6观察细胞形态的病理变化在24孔板里滴一滴完全培养基，然后把专用盖玻片（D=14mm的圆形爬片）放在24孔板里。将细胞悬液以2万个/孔的细胞密度接种。按表1-1分组染毒24h，采用HE染色法观察细胞形态的病理变化，按本课题组前期的实验方法操作[50]。1.2.7观察细胞超微结构使用电子显微镜观察细胞超微结构，实验方法如下图所示：

山西医科大学硕士学位论文7图1-2电镜观察细胞超微结构流程图1.2.8试剂盒检测细胞AST和CRE活力将细胞悬液以100万个/瓶的细胞密度接种24h后。按表1-1分组染毒24h→倒掉原来培养液，PBS洗涤→消化、吹打，离心→倒掉上清，PBS洗涤细胞沉淀→制成体积为500μl的细胞悬液→以100HZ，5s/次，共8次对细胞悬液进行超声破碎→破碎后的细胞悬液根据谷草转氨酶（AST）和肌酐（CRE）试剂盒说明书的方法步骤进行，在510nm和546nm的波长下测定吸光度值。1.2.9统计方法本实验通过SPSS22.0软件对实验数据进行统计学分析，所有结果以x±s表示。以P<0.05作为判断差异具有统计学意义的检验水准。

山西医科大学硕士学位论文82结果2.1砷氟联合染毒对心肌细胞存活率的影响本课题组在前期的实验和查阅大量文献的基础上，选择砷（0，10，25，30，35，40，45和50μM）和氟（0，5，10，20，30，35，40和50mg/L）做预实验进行砷、氟浓度选择。如图1-3所示，与对照组相比，当砷浓度为25μmol/L和氟浓度为35mg/L时，细胞存活率开始显著性降低（P<0.05），其存活率分别为87.0%和84.1%；随着砷、氟浓度的增加，细胞存活率呈剂量依赖性下降。考虑到砷氟联合染毒可能会进一步抑制细胞增殖，因此本实验后续选定的砷浓度为0μM、10μM和25μM，氟浓度为0mg/L，10mg/L和35mg/L，由此组成9个不同剂量的砷氟单独及联合染毒组。如图1-4A所示，不同剂量砷氟染毒12h和24h时，细胞存活率呈上升趋势，并达到最高；48h、72h和96h后，随着时间的延长，细胞存活率呈时间依赖性下降。除As10组和As10F10组外，各染毒组H9c2心肌细胞存活率较对照组均显著性下降（P<0.05）。砷、氟单独组中，As25组和F35组的细胞存活率最低，分别为86.0%和86.7%。砷氟联合组中，A25F35联合组的细胞存活率最低，存活率为77.7%（见图1-4B）。注：与对照组比较*：P<0.05，**：P<0.01图1-3砷、氟单独染毒对H9c2心肌细胞存活率的影响
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