靶向UHRF1蛋白SRA结构域小分子抑制剂的筛选
发布时间：2020-11-04 22:04
DNA甲基化谱式的异常可以作为肿瘤诊断、治疗和预后的标志之一。通过抑制DNA甲基转移酶(DNMT)活性,逆转肿瘤细胞中DNA甲基化谱式的异常和促进相关抑癌基因的重新表达,是一种重要的癌症治疗方法。UHRF1是维持性DNA甲基转移酶DNMT1的重要辅助因子,它通过其特异的SRA结构域结合DNA复制过程中产生的半甲基化DNA并介导DNMT1的招募和维持性DNA甲基化。UHRF1在多种肿瘤细胞中高表达,并且可以作为肿瘤治疗的潜在靶点。我们设计了能够抑制UHRF1蛋白的SRA结构域结合半甲基化DNA的小分子化合物,并通过体外和细胞内实验检测其效果。为了寻找靶向UHRF1的SRA结构域的小分子化合物,阳怀宇教授实验室首先通过计算化学的虚拟筛选方法获得了116个潜在的结合SRA结构域的小分子化合物。利用EMSA实验,我们从116个小分子化合物中筛选出6个能够在体外抑制UHRF1结合半甲基化DNA的化合物。通过HPLC方法检测细胞整体的DNA甲基化水平,我们发现42号和68号化合物能够在细胞实验中下调整体的DNA甲基化水平。后续我们通过CCK8试剂盒检测细胞增殖情况、Western Blot检测UHRF1和DNMT1蛋白水平、qRT-PCR检测干扰素信号通路基因的表达情况,我们发现42/68号化合物能够抑制细胞增殖、但不影响UHRF1的转录及蛋白水平、也不会促进干扰素信号通路基因的表达。此外,联合使用42/68号化合物与DNMTs家族抑制剂虽然不能更大幅度地下调细胞的整体DNA甲基化水平,但可以更好地抑制肿瘤细胞生长。综上,我们的实验发现了两个靶向UHRF1的SRA结构域的小分子化合物,该化合物可以作为UHRF1-SRA的潜在小分子抑制剂。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R965.1
【部分图文】：
华东师范大学硕士学位论文2在恶性增殖的细胞系中测试表型反应，检测小分子化合物对细胞增殖、细胞凋亡或细胞周期的影响。在检测这些表型变化的同时，还要通过分子生物学等方法寻找潜在的分子机制；3）随后在动物体内测试这些在体外筛选到的具有潜力的小分子化合物，检测在肿瘤动物模型中是否可以提供生存方面的治疗益处。在动物研究过程中，也要提供关于药物毒性和药代动力学特性等信息；4）根据这些临床前的研究结果，潜在的候选分子才可被带入临床环境；5）当新药在临床试验中证明是有益的时侯，才会被FDA等监管机构批准用于常规临床治疗3。图1.1部分表观遗传药物开发的过程及当前状态31.2肿瘤细胞和正常细胞的表观遗传修饰差异基因正常有序的转录是机体细胞行使正常功能的前提，如果基因转录调控功能失调，细胞就可能发生癌变。DNA甲基化、组蛋白修饰等是表观遗传调控机制的重要组成部分。与正常细胞相比，肿瘤细胞内的表观遗传修饰发生了明显的改变。肿瘤细胞内DNA甲基化谱式发生改变。与正常细胞相比，肿瘤细胞基因组
华东师范大学硕士学位论文3中的转座子、重复序列区域的DNA甲基化水平明显下降，导致基因组整体DNA甲基化水平的下降。这会促进原先沉默的转座子发生转录，导致基因组序列重排、基因组的不稳定及细胞增殖异常等。相反，肿瘤细胞中抑癌基因的启动子区域DNA甲基化水平明显升高，这会导致抑癌基因沉默，促进癌症的发生发展10-12。很多研究表明，肿瘤细胞的DNA甲基化谱式可以用作定义肿瘤类型、临床治疗和预后的标志13,14。对多种肿瘤细胞的基因组进行测序发现，原先正常未甲基化的启动子CpG岛中有5％-10％的启动子会发生异常高甲基化，而且启动子处的CpG岛发生超甲基化后，不仅会影响蛋白质编码基因的表达，还会影响各种非编码RNA的表达，其中一些非编码RNA还参与了细胞的恶性转化15-18。DNA甲基化与组蛋白修饰之间总是相互影响的。在正常细胞的低DNA甲基化水平的区域，组蛋白H3、H4上的修饰主要以乙酰化为主（H3/H4Ac、H3K4me2/3），而在转座子、重复序列等高甲基化水平的区域，组蛋白H3、H4上的修饰以甲基化为主（H3K27me3、H3K9me3、H4K20me3）。当正常细胞转变为肿瘤细胞后，除了上面说到的DNA甲基化谱式发生改变外，组蛋白的修饰也随着DNA甲基化修饰的改变而改变19。图1.2表观遗传修饰在正常/癌症细胞中的变化19
华东师范大学硕士学位论文171.6靶向UHRF1的治疗到目前为止，所有测试过的天然抗癌化合物都涉及抑癌基因的上调表达，同时还下调了UHRF1的表达123-125。寻找一种可以抑制肿瘤细胞增殖而又不妨碍UHRF1在非癌细胞中发挥其基因组稳定性作用的特异性抑制剂将是很有意义的。图1.6本图介绍了可能利用UHRF1产品或干扰UHRF1相关途径的分子靶向疗法111。（A）UHRF1通路，促进癌症进展和弓形虫增殖，以及通过蛋白酶体降解蛋白质的一般过程。（B）利用干扰UHRF1相关途径的可能疗法。使用合成的UHRF1肽的UHRF1癌症疫苗可用于癌症治疗。UHRF1靶向治疗还包括UHRF1-siRNA，小分子化合物和可渗透的显性负肽抗体疗法不适合UHRF1的分子靶向治疗，原因在于能够用于抗体治疗的靶向蛋白应该是存在于体液内或者细胞膜上的能够被抗体识别的蛋白，而UHRF1在细胞质中合成，在细胞核中发挥作用，所以不能使用抗体疗法。UHRF1-siRNA也不适合用于癌症患者的治疗。虽然针对UHRF1的siRNA能够抑制细胞生长，但是siRNA在血液中容易被血清核酸酶降解，并且它分子量小，呈负电荷，不易被肾小球重吸收而排入尿液。另外如何将siRNA准确输送到目标位置也是另一个重要研究领域。
【参考文献】
本文编号：2870670
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R965.1
【部分图文】：
华东师范大学硕士学位论文2在恶性增殖的细胞系中测试表型反应，检测小分子化合物对细胞增殖、细胞凋亡或细胞周期的影响。在检测这些表型变化的同时，还要通过分子生物学等方法寻找潜在的分子机制；3）随后在动物体内测试这些在体外筛选到的具有潜力的小分子化合物，检测在肿瘤动物模型中是否可以提供生存方面的治疗益处。在动物研究过程中，也要提供关于药物毒性和药代动力学特性等信息；4）根据这些临床前的研究结果，潜在的候选分子才可被带入临床环境；5）当新药在临床试验中证明是有益的时侯，才会被FDA等监管机构批准用于常规临床治疗3。图1.1部分表观遗传药物开发的过程及当前状态31.2肿瘤细胞和正常细胞的表观遗传修饰差异基因正常有序的转录是机体细胞行使正常功能的前提，如果基因转录调控功能失调，细胞就可能发生癌变。DNA甲基化、组蛋白修饰等是表观遗传调控机制的重要组成部分。与正常细胞相比，肿瘤细胞内的表观遗传修饰发生了明显的改变。肿瘤细胞内DNA甲基化谱式发生改变。与正常细胞相比，肿瘤细胞基因组
华东师范大学硕士学位论文3中的转座子、重复序列区域的DNA甲基化水平明显下降，导致基因组整体DNA甲基化水平的下降。这会促进原先沉默的转座子发生转录，导致基因组序列重排、基因组的不稳定及细胞增殖异常等。相反，肿瘤细胞中抑癌基因的启动子区域DNA甲基化水平明显升高，这会导致抑癌基因沉默，促进癌症的发生发展10-12。很多研究表明，肿瘤细胞的DNA甲基化谱式可以用作定义肿瘤类型、临床治疗和预后的标志13,14。对多种肿瘤细胞的基因组进行测序发现，原先正常未甲基化的启动子CpG岛中有5％-10％的启动子会发生异常高甲基化，而且启动子处的CpG岛发生超甲基化后，不仅会影响蛋白质编码基因的表达，还会影响各种非编码RNA的表达，其中一些非编码RNA还参与了细胞的恶性转化15-18。DNA甲基化与组蛋白修饰之间总是相互影响的。在正常细胞的低DNA甲基化水平的区域，组蛋白H3、H4上的修饰主要以乙酰化为主（H3/H4Ac、H3K4me2/3），而在转座子、重复序列等高甲基化水平的区域，组蛋白H3、H4上的修饰以甲基化为主（H3K27me3、H3K9me3、H4K20me3）。当正常细胞转变为肿瘤细胞后，除了上面说到的DNA甲基化谱式发生改变外，组蛋白的修饰也随着DNA甲基化修饰的改变而改变19。图1.2表观遗传修饰在正常/癌症细胞中的变化19
华东师范大学硕士学位论文171.6靶向UHRF1的治疗到目前为止，所有测试过的天然抗癌化合物都涉及抑癌基因的上调表达，同时还下调了UHRF1的表达123-125。寻找一种可以抑制肿瘤细胞增殖而又不妨碍UHRF1在非癌细胞中发挥其基因组稳定性作用的特异性抑制剂将是很有意义的。图1.6本图介绍了可能利用UHRF1产品或干扰UHRF1相关途径的分子靶向疗法111。（A）UHRF1通路，促进癌症进展和弓形虫增殖，以及通过蛋白酶体降解蛋白质的一般过程。（B）利用干扰UHRF1相关途径的可能疗法。使用合成的UHRF1肽的UHRF1癌症疫苗可用于癌症治疗。UHRF1靶向治疗还包括UHRF1-siRNA，小分子化合物和可渗透的显性负肽抗体疗法不适合UHRF1的分子靶向治疗，原因在于能够用于抗体治疗的靶向蛋白应该是存在于体液内或者细胞膜上的能够被抗体识别的蛋白，而UHRF1在细胞质中合成，在细胞核中发挥作用，所以不能使用抗体疗法。UHRF1-siRNA也不适合用于癌症患者的治疗。虽然针对UHRF1的siRNA能够抑制细胞生长，但是siRNA在血液中容易被血清核酸酶降解，并且它分子量小，呈负电荷，不易被肾小球重吸收而排入尿液。另外如何将siRNA准确输送到目标位置也是另一个重要研究领域。
【参考文献】
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本文编号：2870670
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