瞬时受体电位通道TRPC3在增生性瘢痕中的表达及作用

发布时间：2020-11-07 09:55

　　 背景和目的:增生性瘢痕(Hypertrophic scars,HTS)常导致机体功能障碍,目前的临床治疗效果不理想。瘢痕的形成过程是一种动态平衡,即胶原蛋白的合成和降解,当这种平衡被打破,则会形成病理性瘢痕,包括HTS。既往研究证实皮肤烧伤后的增生性瘢痕组织中肌成纤维细胞增多,肌成纤维细胞的增殖开始于肉芽组织形成阶段及活化的肌成纤维细胞聚集后,而这些作用在细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积、过度上皮化和最终的伤口愈合过程中都起着重要作用。HTS的主要成分是collagen-1(Col1a1)和纤连蛋白(fibronectin),它们是参与细胞外基质的主要成分,而α平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,αSMA)主要参与调节肌成纤维细胞的收缩。成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞在创面愈合过程中起着重要作用,探索HTS发生的分子机制有助于增生性瘢痕的防治。转化生长因子β(TGFβ)是一种细胞因子,研究表明哺乳类动物中含有TGFβ1-TGFβ3的表达。TGFβ在调节细胞增殖、分化以及组织纤维化中发挥重要作用,可促进皮肤创面愈合过程中肌成纤维细胞的转分化。此外,TGFβ还参与了αSMA的形成过程,在伤口愈合过程中调节伤口收缩和增加ECM、胶原蛋白和纤粘连蛋白的表达等。包括在慢性溃疡中,TGFβ1同样参与调节皮肤角质细胞和成纤维细胞的增殖。既往文献证实,Smad蛋白作为TGFβ的下游蛋白在细胞内信号转导发挥最重要的作用,研究发现肾脏、肺和肝脏中TGFβ1可通过细胞膜上异二聚体受体使转录因子Smad2/Smad3磷酸化发挥作用。线粒体内Ca~(2+)摄取对调节众多细胞过程和能量代谢至关重要,Ca~(2+)是ROS产生的重要调节物,线粒体基质中的Ca~(2+)超载会损害线粒体功能导致过量的ROS生成,而线粒体内过低的Ca~(2+)浓度可导致ATP生成减少,这提示Ca~(2+)信号和ROS及ATP间存在功能性的联系。线粒体作为最早被认识的钙库,其线粒体的外膜对Ca~(2+)有较好的通透性,内膜具有高度的选择通透性,在维持线粒体膜电位和氧化磷酸化中发挥着重要作用。线粒体丙酮酸脱氢酶(PDH)和数个电子转运复合物与维持线粒体Ca~(2+)内稳态的改变有关。NADPH氧化酶(Nox)4利用NADPH中的离子生成过氧化物,抑制Nox4可减少多种组织损伤模型中肌成纤维细胞的形成和纤维化。最近研究表明TGFβ介导的肌成纤维细胞转分化已被证明与ROS生成增多激活Nox4有关。然而,线粒体内Ca~(2+)超载通过ROS和Nox4/Smad3信号通路在调节肌成纤维细胞转分化中的作用仍不清楚。瞬时受体电位(Transient Receptor Potential Channel,TRP)通道在调控细胞内钙稳态、细胞增殖、迁移和炎症中发挥重要作用。TRP通道是一类对钠、钙等阳离子通透的非选择性阳离子通道,它分为TRPCs,TRPVs及TRPMs等亚型,其中TRPC3是TRPCs亚家族成员之一。研究显示TRP通道与成纤维细胞转分化及创伤愈合伤口收缩有关。TRPC6可激活细胞内Ca~(2+)反应蛋白钙调磷酸激酶,从而诱导肌成纤维细胞转分化及皮肤创面愈合,而TRPA1可促进心肌梗死后心肌成纤维细胞的转分化。我们之前的研究揭示TRPC3表达增加与单核细胞迁移增加及促进线粒体Ca~(2+)摄取和ROS生成增加,这一系列的反应与高血压血管重构有关。既往研究还显示,TRPC6参与血小板活化与糖尿病高血糖激活TRPC6促进血小板钙内流增加有关。也有研究表明TRPC3表达于血管平滑肌细胞线粒体内膜上,参与调控钙库操纵的钙内流(Store Operate Calcium Entry,SOCE)及线粒体Ca~(2+)稳态。但TRPC3在增生性瘢痕中的表达及调控肌成纤维细胞转分化的作用尚不甚清楚。此外,目前对创伤时TGFβ1调控TRPC3介导线粒体钙摄取和ROS生成,调控肌成纤维细胞分化的机制也尚不明确,有待进一步深入阐明。本研究包括两个部分:1.TRPC3在人增生性瘢痕中的表达。2.TRPC3调控成纤维细胞线粒体功能对肌成纤维细胞转分化的作用及机制。我们对门诊就诊的需要做皮肤增生性瘢痕切除术的患者纳入本临床研究,并签署知情同意书,采集患者的一般资料及对皮肤增生性瘢痕进行《改良版温哥华瘢痕量表评分》。患者行增生性瘢痕切除术时收集新鲜的瘢痕组织标本及酌情采集其周围正常的皮肤组织或行整形美容手术切取的多余正常皮肤组织,采用免疫组化、qRT-PCR及Western Blot等技术,明确TRPC3和TGFβ1在增生性瘢痕组织和正常皮肤组织中的表达水平。同时,采用人和TRPC3基因敲除小鼠(Trpc3~(-/-))及野生型小鼠(Trpc3~(+/+))的原代培养的皮肤成纤维细胞,检测成纤维细胞的胞浆钙离子浓度([Ca~(2+)]_i)和线粒体钙摄取([Ca~(2+)]_m),检测细胞及线粒体ROS及ATP生成,阐明TRPC3在增生性瘢痕中的作用,明确TRPC3通过调控NOX4/pSmad信号通路促进成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞的机制,揭示TRPC3参与增生性瘢痕形成的机制。本研究为皮肤增生性瘢痕的防治提供新的干预靶点。材料和方法:整个研究包括离体实验和整体实验。第一部分离体实验,临床纳入皮肤增生性瘢痕的患者,并对皮肤瘢痕进行《改良版温哥华瘢痕量表评分》。手术时收集患者的瘢痕组织及临近的正常皮肤组织或行整形美容手术切取的多余正常皮肤组织为研究对象,采用免疫组化、qRT-PCR等技术,明确TRPC3在人增生性瘢痕及正常皮肤组织中的表达,及TRPC3的表达与瘢痕评分的相关性。第二部分整体实验以Trpc3~(-/-)小鼠和Trpc3~(+/+)小鼠作为研究对象,创建开放性背部皮肤伤口模型,于创伤愈合过程中采集创面肉芽组织,阐明创面愈合过程TRPC3调控新生肉芽组织的肌成纤维细胞αSMA蛋白表达及对增生性瘢痕相关信号分子的作用及机制。细胞实验采用人或Trpc3~(-/-)小鼠和Trpc3~(+/+)小鼠原代培养的皮肤成纤维细胞,明确TRPC3调控线粒体钙摄取及ROS生成的作用,阐明TRPC3调控NOX4/pSmad信号通路在创伤愈合过程中肌成纤维细胞转分化的作用及机制。实验主要方法如下:1.利用qRT-PCR、免疫印迹、免疫组化和免疫荧光染色等分子生物学技术,检测TRPC3、αSMA、TGFβ1、Fibronectin、Col1a1和Nox4/pSmad相关蛋白的表达及分布。2.采用原代培养的人或Trpc3~(-/-)小鼠和Trpc3~(+/+)小鼠成纤维细胞作为研究对象,以TRPC3特异性抑制剂Pyr3和TGFβ1作为药物干预手段,利用全波长酶标仪检测细胞内胞浆钙离子浓度和线粒体钙摄取的变化。3.采用高分辨率线粒体功能测定仪及氧化还原试剂盒,测定成纤维细胞线粒体呼吸功能、ATP及ROS生成的情况。4.以Trpc3~(-/-)小鼠和Trpc3~(+/+)小鼠作为研究对象,在背部创建开放性皮肤伤口模型,在伤口愈合过程中采集创面肉芽组织,采用免疫组化和免疫印迹法检测TRPC3、αSMA、TGFβ1、fibronectin、Col1a1和Nox4/pSmad2/3通路的变化及作用机制。结果:1.与人正常皮肤组织相比较,人增生性瘢痕皮肤组织中TRPC3和TGFβ1蛋白及mRNA表达水平均显著增高,且TRPC3与TGFβ1的mRNA表达水平呈显著正相关。2.成纤维细胞有TRPC3表达,TGFβ1干预可显著上调成纤维细胞TRPC3和αSMA蛋白表达,促进肌成纤维细胞转分化,TRPC3抑制剂Pyr3可逆转TGFβ1的这种作用。3.TGFβ1干预可显著增加成纤维细胞胞浆钙离子浓度([Ca~(2+)]_(cyt))和线粒体钙([Ca~(2+)]_(mito))摄取,增加线粒体ROS生成,减少ATP合成,导致线粒体氧化磷酸化和电子传递减弱。TRPC3抑制剂Pyr3干预可削弱TGFβ1的这种作用,改善线粒体呼吸功能。4.与Trpc3~(+/+)小鼠相比较,Trpc3~(-/-)小鼠创面肉芽组织肌成纤维细胞的标志物αSMA表达显著减少。Trpc3~(-/-)小鼠原代培养的成纤维细胞TGFβ1诱导的钙离子内流也显著减少。Trpc3~(-/-)小鼠创面肉芽组织αSMA、TGFβ1、Fibronectin、Col1a1和NOX4/pSmad2/3蛋白表达均显著减少,提示TRPC3基因敲除可减少肌成纤维细胞转分化及增生性瘢痕形成。结论:1.人增生性瘢痕皮肤组织TRPC3和TGFβ1表达增加。2.TRPC3在成纤维细胞中表达,TGFβ1可上调成纤维细胞TRPC3表达增加线粒体钙摄取和ROS生成,促进肌成纤维细胞转分化。抑制TRPC3能够部分逆转TGFβ1的这种作用。3.TRPC3基因敲除能够抑制TGFβ1诱导的SOCE,减少增生性瘢痕。TRPC3介导的Nox4/pSmad2/3信号通路是创伤后增生性瘢痕形成的机制之一。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R622
【部分图文】：

重庆医科大学硕士研究生学位论文19图1-1TRPC3的分子结构示意图Figure1-1.TheThemolecularstructurediagramofTRPC31材料和方法1.1入选标准1.年龄≥18岁，无智力和语言障碍；瘢痕病程：≥6个月，≤12个月；2.瘢痕至少应满足下列2个条件：高出皮肤表面；颜色红；质地硬；3.患者无皮肤、免疫、传染等全身性疾病；4.瘢痕表面无感染和溃疡；5.无全身系统性纤维化病史；6.术前1年内未使用过激素类药物，瘢痕局部未经放射或注射治疗及其他外用药物治疗。1.2排除标准1.已确诊抑郁症、精神分裂症、脑血管性痴呆者。2.处于哺乳期或妊娠其妇女。3.既往有瘢痕疙瘩病史或家族史。4.不能配合治疗及定期复查者。5.合并糖尿病等全身性代谢疾病或免疫系统存在缺陷影响创面愈合者。1.3研究方法共有21例增生性瘢痕的患者纳入本研究。所有受试者的皮肤组织均取自陆军

重庆医科大学硕士研究生学位论文25图1-1TRPC3、TGFβ1在人的正常皮肤组织及增生性瘢痕中的表达Figure1-1.ImmunohistochemicalstainingofTRPC3andTGFβ1expressioninhypertrophicscartissuesandnormalskintissues.Thescalebarrepresents100μminthe10×images.进一步地采用qRT–PCR检测增生性瘢痕和正常皮肤组织中TRPC3和TGFβ1的mRNA的表达水平，结果表明增生性瘢痕组织中TRPC3mRNA和TGFβ1mRNA表达水平较正常皮肤组织显著增高（p<0.05）（图1-2，表1-1）。图1-2TRPC3、TGFβ1mRNA在人的正常皮肤组织（normalskin）及增生性瘢痕(hypertrophicscar)中的表达Figure1-2.TRPC3andTGFβ1mRNAexpressionlevelsinnormalskintissuesandhypertrophicscartissuesbyqRT-PCR.*p<0.05,vsnormalskin.

重庆医科大学硕士研究生学位论文25图1-1TRPC3、TGFβ1在人的正常皮肤组织及增生性瘢痕中的表达Figure1-1.ImmunohistochemicalstainingofTRPC3andTGFβ1expressioninhypertrophicscartissuesandnormalskintissues.Thescalebarrepresents100μminthe10×images.进一步地采用qRT–PCR检测增生性瘢痕和正常皮肤组织中TRPC3和TGFβ1的mRNA的表达水平，结果表明增生性瘢痕组织中TRPC3mRNA和TGFβ1mRNA表达水平较正常皮肤组织显著增高（p<0.05）（图1-2，表1-1）。图1-2TRPC3、TGFβ1mRNA在人的正常皮肤组织（normalskin）及增生性瘢痕(hypertrophicscar)中的表达Figure1-2.TRPC3andTGFβ1mRNAexpressionlevelsinnormalskintissuesandhypertrophicscartissuesbyqRT-PCR.*p<0.05,vsnormalskin.
【参考文献】

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1 柯昌能;郭小宝;刘坡;陈杰明;;增生性瘢痕瞬时受体电位通道香草醛亚型-1的表达及其意义[J];广西医学;2015年08期

2 丁凤云;兰建云;刘洪;宋祥和;卞勇华;余宏宇;;病理性瘢痕组织中转化生长因子β1的表达及其临床病理学意义[J];临床与实验病理学杂志;2011年10期

本文编号：2873779