艾灸肾俞穴对去卵巢合D-半乳糖注射AD样大鼠早期干预的效应研究

发布时间：2020-11-13 20:29

　　 目的:(1)去势(OVX)合D-半乳糖(D-gal)腹腔注射12周制备阿尔茨海默症样大鼠;(2)观察艾灸肾俞穴对AD样大鼠神经元丢失的保护效应及其对ERK1/2信号通路(细胞外调节蛋白激酶1/2通路)的影响;(3)研究艾灸肾俞穴通过激活海马区ERK/CREB信号通路改善AD样大鼠学习记忆能力及神经元丢失的机理。方法:实验一将12周龄雌性未孕SD大鼠30只随机分为正常组、假手术组和模型组,每组10只。模型组摘除双侧卵巢,术后3d,每日按照150mg/kg/d剂量腹腔注射D-gal。假手术组仅摘除卵巢周围脂肪,每日按照同等剂量腹腔注射0.9%生理盐水,两组均注射12周,术后24h、12周El IS A法检测血清雌激素水平,12周后进行Morris水迷宫、旷场实验、糖水偏好实验等行为学检测,免疫组化法检测海马Aβ1-42表达水平,免疫印迹法检测海马区tau蛋白在PHF-1位点的磷酸化水平;实验二选用12周龄SD雌性未孕大鼠60只,随机分为正常组、假手术组、模型组、肾俞组、胃俞组、非经非穴组,每组10只。除正常组和假手术组外,其它4组均摘除双侧卵巢,术后3d,每日按照150mg/kg/d剂量腹腔注射D-gal(D-半乳糖)90d建立阿尔茨海默病样大鼠模型,假手术组干预方法同实验一。肾俞组、胃俞组、非经非穴组自卵巢切除术后第3d起,采用直径约6mm定制艾条,分别于双侧“肾俞”、“胃俞”、“非经非穴”距离皮肤上2~3cm处悬灸,使局部温度维持在41±0.5℃,每穴10min,每日9:00am开始治疗,每日1次,5日为1疗程,疗程间休息2日,共治疗12个疗程。正常组和假手术组不艾灸,但以相同的方式束缚处理。水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力,免疫组化法检测各组大鼠海马区Aβ1-42和雌激素受体α表达,尼氏染色分析各组大鼠海马区神经元数目及形态变化,免疫印迹法检测各组大鼠海马区p-CREB、p-ERK、ERK、CREB的蛋白表达,ELISA法检测各组大鼠术后24h和干预结束后血清雌二醇水平;实验三将12周龄SD雌性未孕大鼠40只,随机分为正常组、模型组、肾俞组、抑制剂组,每组10只。除正常组外,其它3组均摘除双侧卵巢,术后3d,每日按照150mg/kg/d剂量腹腔注射D-gal90d建立AD样大鼠模型,肾俞组、抑制剂组自卵巢切除术后第3d起,分别于双侧“肾俞”穴距离皮肤上方1~2cm处悬灸,艾灸方法和时间同实验二。抑制剂组干预方法在肾俞组基础上每周皮下注射选择性ERα受体拮抗剂甲基哌啶吡唑(MPP),剂量为0.25mg/kg体重,皮下注射,1次/w,共12w。其他各组干预方法同实验二,检测指标同实验二。结果:实验一水迷宫显示:各组逃避潜伏期均呈现随时间推移而下降。从学习阶段Day2起,与正常组相比,模型组连续5天逃避潜伏期均明显延长。在第14天记忆检测阶段,与正常组比较,模型组连续穿越平台次数明显下降(P0.001);旷场实验显示,与假手术组和正常组比较,模型组上肢上抬次数、5min内移动时间和总距离明显下降(P0.01),5min内穿越格子数明显下降(P0.01)。糖水偏好实验显示,模型组糖水偏好率明显低于假手术组和正常组(P0.01)。血清雌二醇ELISA结果显示:与假手术组和正常组比较,模型组血清雌二醇水平在术后24h以及12周后均明显降低(P0.01)。免疫组化结果显示:模型组海马区Aβ1-42表达较假手术组和正常组均明显增多(P0.01);免疫印迹结果显示:模型组tau蛋白磷酸化水平较假手术组和正常组均明显增多(P0.01);实验二结果:与正常组比较,假手术组各项指标均无明显差异。各组逃避潜伏期均呈现随时间推移而下降。造模后,与正常组比较,从学习阶段Day2起,模型组连续5天逃避潜伏期均明显延长(P0.001),穿越平台次数明显下降(P0.001),海马区Aβ1-42表达明显增多(P0.001),神经元排列紊乱,着色较浅,胞体呈空泡状,以海马CA1、CA3区为主的尼氏小体数量明显下降(p0.001),P-ERK/ERK、P-CREB/CREB水平明显下降(P0.001),雌二醇水平明显下降(P0.001);经过12周艾灸治疗后,与模型组比较,肾俞组连续5天逃避潜伏期明显缩短(P0.01),海马内Aβ1-42表达明显减少(P0.01),且肾俞组Aβ1-42表达明显低于胃俞组和非经非穴组(P0.01,P0.01)。各组ERK和CREB总量没有明显差异;肾俞组和胃俞组海马CA1、CA3区神经元数目明显升高(p0.05,p0.01),肾俞组P-ERK/ERK、P-CREB/CREB水平明显上升(P0.001,P0.001),胃俞组P-ERK/ERK、P-CREB/CREB水平明显上升(P0.01,P0.05);肾俞组逃避潜伏期明显短于胃俞组和非经非穴组(P0.05),海马CA1、CA3区神经元数目明显高于胃俞组和非经非穴组(p0.01),P-ERK/ERK、P-CREB/CREB水平明显高于胃俞组和非经非穴组(P0.05,P0.01);实验三干预三个月后结果,各组海马组织中ERK和CREB总量没有明显差异,各组逃避潜伏期均呈现随时间推移而下降。从学习阶段Day2起,与正常组相比,模型组连续5天逃避潜伏期均明显延长(P0.001),穿越平台次数明显下降(P0.01),海马区Aβ1-42表达明显增多(P0.001),海马区神经元排列紊乱,着色较浅,胞体多呈空泡状,尼氏小体数量稀少,以CA1、CA3区为主神经元数目明显下降(p0.001),PERK和P-CREB水平明显下降(P0.001),海马区ERα表达明显减少(P0.01);经治疗后第3天起,与模型组相比,肾俞组穿越平台次数明显增加(P0.01),连续5天逃避潜伏期明显缩短(P0.001),海马内Aβ1-42表达明显减少(P0.001),CA1、CA3区神经元数目明显增加(p0.01),P-ERK/T-ERK、P-CREB/T-CREB水平明显增加(P0.001),海马区ERα表达明显升高(P0.05);与肾俞组比较,抑制剂组连续5天逃避潜伏期明显呈延长趋势,穿越平台次数明显下降(P0.01),Aβ1-42表达明显升高(P0.001),CA1、CA3区神经元数目组明显少于肾俞组和正常组(p0.05,p0.01),P-ERK/T-ERK、P-CREB/T-CREB水平明显增加(P0.01,P0.05)且ERα表达明显低于肾俞组(P0.01)。结论:VOX合D-gal注射大鼠出现学习记忆能力减退,并伴有抑郁症状,且Aβ淀粉样蛋白和磷酸化tau蛋白含量明显增多,是一种较理想的老年性痴呆样动物模型;艾灸肾俞穴改善AD样大鼠的神经元丢失现象、Aβ异常沉积,其保护神经元效应可能与激活海马区ERK1/2信号通路有关;艾灸肾俞穴可能通过激活AD样大鼠海马区ERα依赖的ERK/CREB信号通路改善去卵巢合D-半乳糖腹腔注射诱导AD样大鼠学习记忆能力及神经元丢失现象。
【学位单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R245.8
【部分图文】：

各组大鼠运动速度（m/s）

图 1 各组大鼠运动速度（m/s） 2.1.2 定位航行实验 造模后，各组逃避潜伏期均呈现随时间推移而下降，正常组和假手术组间无统计学差异。从学习阶段 Day2 起，与正常组相比，模型组连续 5天逃避潜伏期均明显延长（Ｐ＜0.05），说明模型组大鼠学习记忆能力持续下降。（见表１图 2）

艾灸肾俞穴对去卵巢合D-半乳糖注射AD样大鼠早期干预的效应研究142.1.3各组大鼠穿越平台次数如图3所示，正常组和假手术组穿越平台次数无明显差异。与正常组比较，模型组连续穿越平台次数明显下降（Ｐ＜0.001），说明模型组大鼠记忆能力下降（见表2，图3）表2各组大鼠穿越平台次数比较(±s)(次)组别正常组假手术组模型组次数（次）7.0±1.06.0±1.62.0±1.0***注：与正常组比较*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;图3各组大鼠穿越平台次数结果比较(±s)(次)注：与正常组比较*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.2.1.4各组大鼠水迷宫空间探索运行轨迹各组大鼠呈现不同特点运动轨迹：正常组和假手术组呈现“趋向式”搜索策略，模型组呈现AD样大鼠模型常见的“边缘式”搜索策略；见图4。Day14VOX+D-galShamCon图4各组大鼠水迷宫运行轨迹比较
【参考文献】

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本文编号：2882610