益生菌鼠李糖乳杆菌GG菌株发酵液对酒精性肝病保护机制的研究

发布时间：2017-04-06 12:07

  本文关键词：益生菌鼠李糖乳杆菌GG菌株发酵液对酒精性肝病保护机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：酒精性肝病(Alcoholic liver disease, ALD)是指由于长期大量饮酒所导致的一系列肝脏病变,在全球范围内都有着极高的发病率和致死率。长期慢性的酒精摄入可引起肠道微生物菌群的严重失调并破坏肠道的天然屏障功能,造成肠源性内毒素在血液中含量的大幅增加,激活肝脏巨噬细胞启动多种促炎因子的表达以及氧化压力的产生,导致肝脏脂肪性变性和肝细胞受损。针对调节肠道微生态平衡,增强肠道屏障功能,从而预防酒精性肝损伤的研究,已经成为热点。益生菌是一类能够为宿主提供健康效益的活性微生物,其能够在肠道内定植的特性使得益生菌在维护肠道菌群平衡,调节肠道上皮细胞紧密连结中起到至关重要的作用。实验室前期研究表明,鼠李糖乳杆菌GG (Lactobacillus rhamnosus GG, LGG)能够有效抑制肠道有害细菌的过度生长,修复受损的肠道屏障,从而抑制酒精引起的内毒素血症的发生,阻断内毒素介导的肝脏脂肪化以及相应炎症的产生。尽管益生菌治疗酒精性肝病的有效性已经被越来越多的临床试验所证明,但同时,对于免疫力低下以及肠道功能受损的病人,采用大量活菌治疗也存在一定的危险性和不确定性。本论文就LGG灭活的菌株发酵上清液LGGs(Lactobacillus rhamnosus GG supernatant)对酒精性肝病是否具有保护作用以及其具体作用机制进行了研究。通过构建小鼠慢性酒精性肝损伤模型,对LGGs在长期酒精摄入的情况下对肝脏的影响进行探究,实验结果表明,LGGs能够有效缓解肝脏细胞的脂肪性变性,显著抑制肝脏巨噬细胞激活的相关炎症反应。在对小鼠肠道样本的分析以及血清酶学检测中发现,LGGs对酒精引起的肠道上皮细胞通透性的增加具有显著抑制作用,能够有效阻止内毒素血症的发生,从一定程度上预防和缓解酒精摄入引起的肝损伤。进一步的,本课题利用人结肠癌上皮细胞系构建酒精性肠道上皮屏障损伤模型,对LGGs降低肠道上皮细胞通透性,增强屏障功能的具体机制进行探究。研究发现,LGGs能够通过抑制miR122a在肠道中的表达,促进肠道上皮细胞紧密连接蛋白Occludin的分泌,从而加强肠道上皮细胞间的屏障功能。此外,实验室前期研究表明,酒精摄入引起缺氧诱导因子(HIF)的表达大幅降低,HIF是细胞缺氧适应及炎症发展的关键转录因子。酒精导致由HIF介导的对肠粘膜的再生和修复有重要作用的肠三叶因子(ITF)的表达受阻,破坏肠道的天然屏障。而LGG被证明能够抑制酒精对HIF表达的影响,促进肠道杯状细胞释放ITR修复受损的肠道屏障。本论文对HIF所介导的两个主要肠道屏障相关蛋白ITF以及Cathelin相关抗菌肽(CRAMP)的功能进行探究,发现ITF能够有效抑制血小板活化因子(PAF)引起的肠道上皮细胞通透性升高,而CRAMP则对不同种类的细菌表现出选择性抑菌作用：大肠杆菌、李斯特菌等致病菌的生长被显著抑制而LGG则生长状况良好。另外,本论文对益生菌的重要代谢产物短链脂肪酸(SCFA)家族中的丁酸(butyrate)对HIF表达的调节作用进行初步研究,实验结果表明,丁酸盐(NaB)能够大幅提升铁螯合剂(DFO)诱导的HIF表达的升高,表明益生菌有可能通过分泌短链脂肪酸这一类有益代谢物来调节肠道屏障。本研究对于更好地理解酒精性肝病致病机理以及益生菌对酒精性肝病保护作用的具体机制具有重大意义,为酒精性肝病的预防和治疗提供了新的思路和手段。
【关键词】：酒精性肝病 益生菌 肠上皮细胞紧密连结 缺氧诱导因子
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.5
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 英文缩略12-13
• 第一章 绪论13-22
• 1.1 酒精性肝病概况13
• 1.2 酒精性肝病发病机制13-16
• 1.2.1 酒精及其代谢产物引起的肝细胞损伤14
• 1.2.2 氧化应激与脂质过氧化14-15
• 1.2.3 肠源性内毒素介导的肝脏损伤15-16
• 1.3 酒精性肝病的诊断和治疗16-17
• 1.3.1 传统治疗手段16-17
• 1.3.2 新型疗法17
• 1.4 益生菌在酒精性肝病中的应用17-19
• 1.4.1 益生菌定义17-18
• 1.4.2 益生菌在肝脏疾病中的应用18-19
• 1.5 肠道屏障作用19-21
• 1.5.1 肠道屏障的组成19-20
• 1.5.2 miR122a对肠道屏障的调控20
• 1.5.3 缺氧诱导因子以及短链脂肪酸20-21
• 1.6 研究内容和意义21-22
• 第二章 实验材料和方法22-31
• 2.1 酒精性肝损伤以及LGGs治疗酒精性肝损伤的小鼠模型的构建22
• 2.1.1 小鼠模型的构建22
• 2.1.2 人结肠癌细胞Caco-2细胞的培养22
• 2.2 实验材料22-25
• 2.2.1 实验所用菌株22-23
• 2.2.2 实验仪器23
• 2.2.3 实验试剂23-24
• 2.2.4 实验所用引物及菌株24-25
• 2.3 实验方法25-31
• 2.3.1 血液生化分析25
• 2.3.2 肝脏甘油三酯检测25
• 2.3.3 检测肝脏中细胞因子的含量25
• 2.3.4 肝脏病理组织学分析25-27
• 2.3.5 肝脏脂肪分析,油红O染色27
• 2.3.6 总RNA的提取以及实时荧光定量RT-PCR27-28
• 2.3.7 细胞及组织中总蛋白的提取28
• 2.3.8 BCA法测蛋白浓度28-29
• 2.3.9 蛋白质免疫印迹(Western Blot)分析29
• 2.3.10 跨上皮细胞电阻(TEER)的测定及FD-4渗透性实验29
• 2.3.11 荧光素酶实验29-30
• 2.3.12 统计学分析30-31
• 第三章 实验结果31-44
• 3.1 LGGs在小鼠酒精肝模型中对肝脏的保护作用31-35
• 3.1.1 LGGs改善酒精喂养小鼠肝脏的脂肪变性31-34
• 3.1.2 LGGs有效缓解酒精引起的肝脏损伤34-35
• 3.2 LGGs对酒精引起肠道功能紊乱的影响35-39
• 3.2.1 LGGs对酒精引起的肠道渗透性变化的影响35-37
• 3.2.2 LGGs对肠道紧密连接蛋白的影响37-38
• 3.2.3 LGGs在回肠以及Caco-2细胞中对miR122a表达的影响38-39
• 3.3 缺氧诱导因子HIF调控的肠道屏障相关蛋白的功能研究39-44
• 3.3.1 抗菌肽CRAMP的选择性抑菌作用39-41
• 3.3.2 肠三叶因子对Caco-2细胞肠道屏障完整性的作用41-42
• 3.3.3 丁酸对缺氧诱导因子的调控作用42-44
• 第四章 小结与讨论44-47
• 4.1 小鼠肝脏及血清的病理分析44
• 4.2 LGGs通过抑制miR122a的表达上调Occludin表达44-45
• 4.3 缺氧诱导因子在转录水平调控的肠道屏障相关蛋白功能的初步研究45-47
• 参考文献47-54
• 在读期间科研成果54-55
• 致谢55

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