载雷公藤红素还原敏感型聚合物胶束的制备及体外抗卵巢癌评价
发布时间：2020-11-18 17:15
国家癌症中心指出,卵巢癌死亡率居于妇科恶性肿瘤首位。目前卵巢癌的治疗方式以手术和化疗为主,手术只是小范围单纯切除,术后复发率较高,而化疗药物进入体内后较少有生物选择性,在杀伤正常细胞的同时会对机体正常组织造成毒副作用。雷公藤红素(Celastrol,CEL)具有较强的抗卵巢癌疗效,但它水溶性差,生物利用度低,且毒性较大。卵巢癌细胞表面过表达整合素α_νβ_5受体、胞内也过表达泛素连接酶TRAF6,且癌细胞内的还原物质谷胱甘肽GSH浓度是2-10 mM,约为肿瘤细胞外GSH浓度(2-20μM)的1000倍。为了克服CEL的不足,本论文设计、合成了具有主动靶向功能的还原敏感型纳米载体,用于CEL的肿瘤细胞靶向传递和胞内响应性释药。本课题分为四章:第一章,制备了聚合物分子mPEG-C_(18)、mPEG-SS-C_(18)、cRGD-PEG-C_(18)、TIP-PEG-C_(18),利用~1H-NMR谱图验证合成产物结构,计算多肽接枝率。结果表明:各聚合物分子已成功合成,cRGD-PEG-C_(18)中cRGD的接枝率为37.5%,TIP-PEG-C_(18)中TIP的接枝率为20.2%。第二章,制备了有靶向性和有还原敏感性的双功能聚合物胶束cRGD/TIP/mPEG-SS-C_(18),同时制备出了无靶向性和无还原敏感性的无功能聚合物胶束mPEG-C_(18),以及无靶向性但有还原敏感性的单功能聚合物胶束mPEG-SS-C_(18)作为对照,筛选出cRGD肽的最佳密度,并对其进行表征。结果表明:cRGD肽的最佳密度为12%,mPEG-C_(18)、mPEG-SS-C_(18)及cRGD/TIP/mPEG-SS-C_(18)胶束平均粒径分别为290.60nm、269.35 nm、224.33 nm;PDI分别为0.259、0.202、0.248;Zeta电位分别为-9.74 mV、-5.84 mV、-7.66 mV,胶束呈现均一且规则的球形结构;芘荧光探针法测定了mPEG-C_(18)、mPEG-SS-C_(18)及cRGD/TIP/mPEG-SS-C_(18)胶束的CMC值分别为85 mg/L、68 mg/L、63 mg/L,显示出良好的稀释稳定性;将聚合物胶束和单核巨噬细胞RAW264.7以及卵巢癌细胞A2780共培养后,细胞存活率均在82%以上,溶血实验结果显示聚合物胶束的HR%均小于5%,细胞毒性实验和溶血实验共同验证聚合物胶束具有良好的生物相容性。第三章,制备了mPEG-C_(18)/CEL、mPEG-SS-C_(18)/CEL、cRGD/TIP/mPEG-SS-C_(18)/CEL载药胶束,并对其进行表征。结果表明:mPEG-C_(18)/CEL、mPEG-SS-C_(18)/CEL、cRGD/TIP/mPEG-SS-C_(18)/CEL载药胶束平均粒径分别为282.0 nm、304.1 nm、215.2 nm,PDI分别为0.39、0.38、0.28,Zeta电位分别为-9.53 mV、-13.6 mV、-6.51 mV;胶束呈规则的球形、外观圆整、分散均一;mPEG-C_(18)/CEL、mPEG-SS-C_(18)/CEL、cRGD/TIP/mPEG-SS-C_(18)/CEL三种载药胶束的载药量分别为3.08%、2.63%、3.02%,包封率分别为99.63%、85.23%、87.34%;体外释药实验的60 h内,cRGD/TIP/mPEG-SS-C_(18)组累积释药率为81%,为mPEG-C_(18)组的1.56倍,表现出明显的还原敏感特性;溶血实验中载药胶束的HR%均小于5%,证明载药胶束也具有良好的生物相容性;DLS考察载药胶束具有长期稳定性。第四章,考察了mPEG-C_(18)/CEL、mPEG-SS-C_(18)/CEL、cRGD/TIP/mPEG-SS-C_(18)/CEL载药胶束对A2780细胞的毒性以及细胞摄取情况。细胞毒性实验表明:与mPEG-C_(18)/CEL、mPEG-SS-C_(18)/CEL胶束相比,cRGD/TIP/mPEG-SS-C_(18)/CEL胶束对A2780细胞的生长增殖具有明显的抑制作用,通过CLSM显示靶向多肽的结合有利于增强肿瘤细胞对药物的摄取效率,cRGD/TIP/mPEG-SS-C_(18)胶束具有主动靶向性。本文构建的有靶向性和有还原敏感性的双功能聚合物载药胶束cRGD/TIP/mPEG-SS-C_(18)/CEL可以提高疏水性药物CEL的溶解性,提高肿瘤细胞对纳米粒的摄取效率,降低CEL的毒副作用,显现出良好的抗肿瘤效果,为临床上卵巢癌的治疗提供一定的实验依据,具有较广阔的应用前景。
【学位单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R283.6
【部分图文】：
载雷公藤红素还原敏感型聚合物胶束的制备及体外抗卵巢癌评价2凋亡[7]。CEL通过下调人卵巢癌细胞SW620内的p-Akt、NF-κB、Survivin蛋白表达，激活caspase-7、caspase-3和PARP信号，阻滞细胞周期于G2/M期[8]。CEL与青蒿素、雷公藤甲素、辣椒素以及姜黄素于2007年就已被Cell杂志列为最有可能被开发成为现代药物的五种传统天然药物化合物[9]。尽管CEL具有较好的抗癌作用，但CEL为难溶性抗癌药物，口服生物利用度较低，且自身毒性较大，容易对机体产生全身性的毒副作用。其物理化学性质限制了它在临床上的应用，因此临床上并未见CEL相关制剂用于卵巢癌的治疗。近年来，纳米载体材料受到了广泛关注，采用药物制剂新技术，可提高难溶性药物溶解度和生物利用度，提高药物稳定性并降低药物毒性，起到“增效低毒”的抗癌作用。图1雷公藤红素的分子结构式Fig.1ThemolecularstructuralformulaofCEL.3TRAF6仿生抑制肽泛素连接酶与肿瘤细胞的发生、发展密切相关，参与着细胞周期、信号传导、DNA修复等过程。肿瘤坏死因子受体相关因子6（Tumornecrosisfatorreceptorassociatedfators6，TRAF6）作为一种泛素连接酶，属于肿瘤坏死因子相关因子家族，该家族共包含7个成员（TRAF1-7），其中TRAF6在信号转导方面表现独特，因为它不仅能传导与TNF超家族有关的信号，而且可以作为Toll样受体（TLR）/白细胞介素1受体IL-1R（TIR）超家族重要的接头蛋白[10]。TRAF6在不同的细胞系以及人体组织中都有表达分布。目前很多研究发现在多种肿瘤组织中都存在TRAF6蛋白的异常表达与激活现象，这些组
载雷公藤红素还原敏感型聚合物胶束的制备及体外抗卵巢癌评价14图1-1mPEG-C18(A)、mPEG-SS-C18(B)、cRGD-PEG-C18、TIP-PEG-C18(C)的合成示意图Fig.1-1SynthesisroutesofmPEG-C18(A)、mPEG-SS-C18(B)、cRGD-PEG-C18、TIP-PEG-C18(C)3.2两嵌段聚合物mPEG-C18、mPEG-SS-C18的表征mPEG-C18的核磁图谱如图1-2，δ=3.62ppm（a，-CH2-CH2-inmPEGunits）为mPEG骨架-CH2CH2O-中H的振动峰，δ=3.42ppm（d，CH3O-inmPEGunits）为mPEG末端甲氧基的特征峰；δ=1.26ppm（b，
载雷公藤红素还原敏感型聚合物胶束的制备及体外抗卵巢癌评价15-CH2-inC18units）以及δ=0.87ppm(c，-CH3inC18units)分别为C18链段中亚甲基和末端甲基的特征峰。在核磁图谱上（图1-2）能观察到PEG和C18两个组分的信号，证明嵌段共聚物的形成。图1-2mPEG-C18的1H-NMR图谱（*氘代试剂的溶剂峰/溶剂中残余水峰）Fig.1-21H-NMRspectraofofmPEG-C18（*solventpeakofdeuteriumreagent/residualwaterpeakinsolvent)mPEG-SS-C18核磁图谱如图1-3，δ=3.62ppm（a，-CH2-CH2-inmPEGunits）和δ=3.42ppm（d，CH3O-inmPEGunits）分别是mPEG骨架-CH2CH2O-和末端甲氧基的特征峰；δ=2.88ppm（f,-CH2CH2SSCH2CH2-），2.58ppm（g，-CH2CH2SSCH2CH2-）为二硫键两旁的亚甲基特征峰；δ=2.98（e，-NHCH2-inC18units）,δ=1.26ppm（b，-(CH2)16-CH3inC18units），δ=0.87ppm(c，-(CH2)16-CH3inC18units)分别为C18链段的亚甲基以及末端甲基特征峰。核磁图谱上（图1-3）不仅显示出PEG和C18两个组分的信号，还有二硫键旁亚甲基的信号，证明含-SS-嵌段共聚物的结构。另外，在缩合反应实验中，澄清的反应溶液中有白色副产物析出，即DCU的生成，这一现象也表明DCC缩合反应的发生。
【参考文献】
本文编号：2888972
【学位单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R283.6
【部分图文】：
载雷公藤红素还原敏感型聚合物胶束的制备及体外抗卵巢癌评价2凋亡[7]。CEL通过下调人卵巢癌细胞SW620内的p-Akt、NF-κB、Survivin蛋白表达，激活caspase-7、caspase-3和PARP信号，阻滞细胞周期于G2/M期[8]。CEL与青蒿素、雷公藤甲素、辣椒素以及姜黄素于2007年就已被Cell杂志列为最有可能被开发成为现代药物的五种传统天然药物化合物[9]。尽管CEL具有较好的抗癌作用，但CEL为难溶性抗癌药物，口服生物利用度较低，且自身毒性较大，容易对机体产生全身性的毒副作用。其物理化学性质限制了它在临床上的应用，因此临床上并未见CEL相关制剂用于卵巢癌的治疗。近年来，纳米载体材料受到了广泛关注，采用药物制剂新技术，可提高难溶性药物溶解度和生物利用度，提高药物稳定性并降低药物毒性，起到“增效低毒”的抗癌作用。图1雷公藤红素的分子结构式Fig.1ThemolecularstructuralformulaofCEL.3TRAF6仿生抑制肽泛素连接酶与肿瘤细胞的发生、发展密切相关，参与着细胞周期、信号传导、DNA修复等过程。肿瘤坏死因子受体相关因子6（Tumornecrosisfatorreceptorassociatedfators6，TRAF6）作为一种泛素连接酶，属于肿瘤坏死因子相关因子家族，该家族共包含7个成员（TRAF1-7），其中TRAF6在信号转导方面表现独特，因为它不仅能传导与TNF超家族有关的信号，而且可以作为Toll样受体（TLR）/白细胞介素1受体IL-1R（TIR）超家族重要的接头蛋白[10]。TRAF6在不同的细胞系以及人体组织中都有表达分布。目前很多研究发现在多种肿瘤组织中都存在TRAF6蛋白的异常表达与激活现象，这些组
载雷公藤红素还原敏感型聚合物胶束的制备及体外抗卵巢癌评价14图1-1mPEG-C18(A)、mPEG-SS-C18(B)、cRGD-PEG-C18、TIP-PEG-C18(C)的合成示意图Fig.1-1SynthesisroutesofmPEG-C18(A)、mPEG-SS-C18(B)、cRGD-PEG-C18、TIP-PEG-C18(C)3.2两嵌段聚合物mPEG-C18、mPEG-SS-C18的表征mPEG-C18的核磁图谱如图1-2，δ=3.62ppm（a，-CH2-CH2-inmPEGunits）为mPEG骨架-CH2CH2O-中H的振动峰，δ=3.42ppm（d，CH3O-inmPEGunits）为mPEG末端甲氧基的特征峰；δ=1.26ppm（b，
载雷公藤红素还原敏感型聚合物胶束的制备及体外抗卵巢癌评价15-CH2-inC18units）以及δ=0.87ppm(c，-CH3inC18units)分别为C18链段中亚甲基和末端甲基的特征峰。在核磁图谱上（图1-2）能观察到PEG和C18两个组分的信号，证明嵌段共聚物的形成。图1-2mPEG-C18的1H-NMR图谱（*氘代试剂的溶剂峰/溶剂中残余水峰）Fig.1-21H-NMRspectraofofmPEG-C18（*solventpeakofdeuteriumreagent/residualwaterpeakinsolvent)mPEG-SS-C18核磁图谱如图1-3，δ=3.62ppm（a，-CH2-CH2-inmPEGunits）和δ=3.42ppm（d，CH3O-inmPEGunits）分别是mPEG骨架-CH2CH2O-和末端甲氧基的特征峰；δ=2.88ppm（f,-CH2CH2SSCH2CH2-），2.58ppm（g，-CH2CH2SSCH2CH2-）为二硫键两旁的亚甲基特征峰；δ=2.98（e，-NHCH2-inC18units）,δ=1.26ppm（b，-(CH2)16-CH3inC18units），δ=0.87ppm(c，-(CH2)16-CH3inC18units)分别为C18链段的亚甲基以及末端甲基特征峰。核磁图谱上（图1-3）不仅显示出PEG和C18两个组分的信号，还有二硫键旁亚甲基的信号，证明含-SS-嵌段共聚物的结构。另外，在缩合反应实验中，澄清的反应溶液中有白色副产物析出，即DCU的生成，这一现象也表明DCC缩合反应的发生。
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 杨涛;李文娟;周从山;;芘荧光探针光谱法测定CTAB临界胶束浓度[J];石化技术与应用;2007年01期
2 平其能;纳米药物和纳米载体系统[J];中国新药杂志;2002年01期
3 李平;丁达尔效应实验的新光源[J];天津师范大学学报(基础教育版);2000年02期
相关博士学位论文 前2条
1 金光明;聚乙二醇化多西他赛白蛋白纳米粒的制备及其抗人非小细胞肺癌的研究[D];延边大学;2016年
2 胡永胜;基于生物技术和质谱技术的雷公藤红素及其类似物抗癌机制研究[D];第二军医大学;2013年
本文编号：2888972
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