纳米氧化铝胚胎暴露致成年斑马鱼的学习和记忆能力进行性损伤

发布时间：2020-11-18 22:17

　　 目的:纳米氧化铝由于其优良的物理化学性质,在光电子、催化剂、工程、医药等领域得到了广泛的应用。在生产过程中,纳米氧化铝可在产品制造、加工和废物排放等过程中直接或间接释放到环境中。当生物体内蓄积纳米氧化铝颗粒在达到一定阈值后可能会出现毒性效应。然而,现有的毒理学证据很难确切地评估纳米氧化铝对水生生物和人体的潜在风险。因此,本研究旨在探讨纳米氧化铝对成年斑马鱼学习和记忆能力的影响。方法:采用不同浓度(0、6.25、12.5、25.0、50.0、100 mg/L)的13 nm粒径的氧化铝处理受精后6 h的斑马鱼胚胎至受精后120 h结束,并在成年时(6、9和12月龄)检测其神经行为学指标,评价学习记忆能力;本研究设计了一组实验来评估斑马鱼胚胎期接触纳米氧化铝是否会蓄积在大脑组织中并对其学习和记忆能力造成损害。我们用电子显微镜观察了纳米氧化铝的表征,并用纳米粒度仪测定了Zeta电位。采用焦虑活动检测试验、探索活动检测试验和T迷宫试验,观察了成年斑马鱼6、9和12月龄的神经行为和学习记忆变化。此外,测定了脑组织中乙酰胆碱(ACh)、多巴胺(DA)等神经递质生物标志物,活性氧(ROS)、乳酸脱氢酶(LDH)等氧化应激标志物。另外,使用尼氏染色法检测了脑组织神经细胞数目变化,通过电镜观察了脑组织亚细胞结构的病理形态改变,RT-PCR检测了自噬相关基因(ULK1、LC3-Ⅱ、Beclin-1)的表达,使用ICP-MS检测了斑马鱼脑组织铝的蓄积变化。结果:(1)脑铝含量增加:纳米氧化铝斑马鱼胚胎暴露,导致6和12月龄的斑马鱼脑组织中铝含量增加,且存在剂量依赖效应,脑铝含量随剂量增加而升高。(2)焦虑样行为加重:纳米氧化铝斑马鱼胚胎暴露,导致6、9和12月龄的斑马鱼焦虑样行为增加,包括平均速度和外区累积时间百分比显著减少,冻结时间移动率增加。且存在剂量和年龄依赖效应,随剂量和年龄增加,焦虑样行为逐渐加重。(3)新环境的探索行为减弱:纳米氧化铝斑马鱼胚胎暴露,导致6、9和12月龄的斑马鱼对新环境的探索行为减弱,且存在剂量和年龄依赖效应,随剂量和年龄增加,探索行为逐渐减弱。(4)记忆能力降低:纳米氧化铝斑马鱼胚胎暴露,导致6和12月龄的斑马鱼学习记忆能力降低,且存在剂量和年龄依赖效应,包括潜伏期增加和累积停留时间减少。随剂量和年龄增加,学习记忆能力出现进行性损伤。(5)神经递质含量降低:纳米氧化铝斑马鱼胚胎暴露,导致6和12月龄的斑马鱼脑组织神经递质含量降低,包括乙酰胆碱(ACh)和多巴胺(DA)的水平显著下降。(6)氧化应激反应加重:纳米氧化铝斑马鱼胚胎暴露,导致6和12月龄的斑马鱼脑组织氧化应激反应加重,包括活性氧(ROS)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平显著增加。(7)纳米氧化铝斑马鱼胚胎暴露,导致斑马鱼脑组织神经细胞数目减少且伴随着自噬的发生,以及脑组织中自噬相关基因(ULK1、LC3-Ⅱ、Beclin-1)的表达上调。结论:纳米氧化铝在6.25 mg/L至100 mg/L的暴露浓度范围内对斑马鱼具有神经毒性,我们发现低浓度(6.25 mg/L)的纳米氧化铝对6个月龄前的斑马鱼比较安全。随着暴露剂量和持续时间的增加,包括低浓度(6.25 mg/L)在内的所有剂量的纳米氧化铝都会引起斑马鱼学习和记忆的不良影响。斑马鱼胚胎期接触纳米氧化铝对斑马鱼脑组织中的铝含量具有剂量和年龄依赖性,并且随着剂量和年龄的增加而显著增加。暴露于纳米氧化铝会导致进行性神经行为改变,学习记忆能力进行性损伤。它还会导致斑马鱼脑组织中产生氧化应激和多巴胺能传递受到破坏,脑组织中神经细胞的数量显著减少且伴随着自噬的发生。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R114
【部分图文】：

山西医科大学硕士学位论文81.4.3纳米氧化铝暴露本项研究由1个对照组和5个暴露组组成。将6hpf的对照组置于斑马鱼胚胎培养基中，每日更换胚胎培养液一次。各实验组暴露于不同浓度（0、6.25、12.5、25.0、50.0、100mg/L）的纳米氧化铝悬浊液中，每天更换新的纳米氧化铝悬浊液一次。实验在28.5℃恒温孵育箱中进行，光/暗循环14/10小时。每12h检查各组胚胎发育情况，及时取出卵凝结的胚胎和死亡幼体。120hpf停止暴露纳米氧化铝。每个暴露剂量组和对照组分别选取70颗鱼卵进行培养，6月龄时，排除生长过程中一些不可控因素导致的个别斑马鱼的死亡影响，每组剩余约60条成鱼，这些成年鱼被用于检测斑马鱼学习记忆能力损伤及其机制。在斑马鱼成鱼6、9和12月龄时检测各种实验指标，包括：脑铝含量（Alcontentinbrain）、自发运动（locomotoractivity）、探索运动（exploratoryactivity）、学习记忆能力（learningandmemory）、神经递质（neurotransmitters）、氧化应激（oxidativestress）、神经细胞计数（neuralcellscount）、超微结构（ultrastructuralstructure）、基因表达（geneexpression）。所有的行为测试都在上午9:00到下午5:00之间进行[45]，详细实验设计如图1所示。图1纳米氧化铝暴露斑马鱼胚胎后对成年斑马鱼各种指标检测的实验设计图Figure1DiagramoftheexperimentaldesignusedtotestadultzebrafishaftertreatedzebrafishembryoswithAl2O3-NPs.

山西医科大学硕士学位论文11间，每条斑马鱼都被单独放置在T迷宫中测试。斑马鱼的行为由摄像机记录，并由EthovisionXT10软件分析。实验测试包括3个阶段：（1）斑马鱼对T迷宫进行为期4天的适应阶段（habituation），以适应新环境。在适应阶段，所有斑马鱼都被放入T迷宫中，但数量每天逐渐减少（16、8、4和1），直到每条鱼被单独放入T迷宫中并自由游动。（2）为期4天的训练试验（trainingtest）。训练试验旨在通过食物刺激，训练斑马鱼出现在食物奖励区，并给予食物奖励，培养斑马鱼的联想学习记忆能力[51]。在训练试验过程中，将每条鱼放在T迷宫的起始区域，30秒后释放，让斑马鱼在T迷宫中探索4分钟。潜伏期定义为斑马鱼从起始区域游到EC区所需的时间。在训练期间，如果斑马鱼在4分钟的测试时间内没有出现在EC区，它将被引导到EC区，并允许它在其中停留1分钟。训练测试从每天早上9:00开始[45]，连续4天每天1次。（3）在最后一次训练试验的第2天进行记忆能力测试试验，以评估记忆能力。在此阶段，所有斑马鱼被单独放入同一个T型迷宫中游动4分钟，但不以食物作为奖励。分析了斑马鱼在EC区的累计停留时间。具体实验流程（如图2）图2T迷宫实验箱及T迷宫实验流程图Figure2.T-mazeapparatusexperimenttankandflowchartofT-mazetest.

2.1 氧化铝纳米颗粒的表征 将纳米氧化铝悬浊液超声 30 min 混匀，然后用透射电子显微镜检测。通过图像分析软件分析纳米氧化铝颗粒悬浊液的透射电镜结果，悬浊液中的纳米氧化铝颗粒显示呈圆形，并没有明显的聚集，平均粒径为（20.90±9.51）nm ，如图3。采用纳米粒度仪对纳米氧化铝悬浊液进行分析，结果表明：纳米氧化铝的平均水合粒径为（86.89±10.87）nm，平均 Zeta 电位为（49.43±2.21）mv。
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本文编号：2889279