基于GST活性研究环磷酰胺对白消安在Beagle犬体内药动学的影响

发布时间：2020-11-21 02:06

　　 目的:采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法建立白消安(busulfan,Bu)在Beagle犬体内的定量测定方法,对白消安在Beagle犬体内不同给药途径的药动学特征进行评价;测定Beagle犬体内谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性,研究白消安和环磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)对GST活性的影响,并通过不同给药组的药动学数据以及GST活性,从而探讨由GST介导的环磷酰胺对白消安药动学的影响,为临床合理用药提供实验依据。方法:1.白消安在Beagle犬体内定量测定方法的建立使用柱前衍生方法,对白消安进行衍生化处理,衍生化试剂为二乙基二硫代氨基甲酸钠(sodium diethyldithiocarbamate,DDTC),内标(internal standard,IS)选定为1,5-戊二醇二甲磺酸酯,色谱柱为Diamonsil(Ⅱ)C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm),柱温为30℃,流动相为甲醇-水(54:46),流速为1.0 mL·min~(-1),检测波长为280 nm,进样体积为25μL,从专属性、标准曲线和定量下限、精密度和准确度、萃取回收率、稳定性等方面进行方法学验证,建立白消安体内测定方法。2.白消安在Beagle犬体内静脉注射和口服给药的药动学研究成年健康Beagle犬3只,进行双周期交叉试验。白消安以静脉注射和口服两种给药途径给药,剂量分别为0.898 mg·kg~(-1)和1.5 mg·kg~(-1)。于犬一侧前肢静脉埋入留置针采血,血样经37℃水浴30 min,4000 r·min~(-1)离心10 min后得血清样品。血清样品经蛋白沉淀和衍生化预处理后,进样分析,测定白消安血药浓度,采用非隔室模型,通过药动学软件DAS 3.2计算静注和口服给药的血药浓度-时间曲线下面积(area under the curve,AUC),平均滞留时间(mean residence time,MRT),表观分布容积(apparent volume of distribution,V),比较两种给药方式的药动学特征。3.GST活性测定以及白消安和环磷酰胺对GST活性的影响成年健康Beagle犬3只,分别静注白消安和口服环磷酰胺,进行双周期交叉试验。白消安静注剂量为0.898 mg·kg~(-1),环磷酰胺口服剂量为14.96 mg·kg~(-1)。于给药后1 h时采集血清样品,使用紫外分分光度法测定样本GST活性,分析两种药物分别对GST活性的影响。4.白消安和环磷酰胺联用时的药动学研究和GST活性测定成年健康Beagle犬3只,进行双周期交叉试验。给药方案设置为Cy预处理给药组和Bu/Cy同时给药组。Cy预处理组具体给药方案为连续4天口服环磷酰胺,并于第4天给药环磷酰胺1 h后,静注白消安;Bu/Cy同时组给药方案为在30 s内静脉注射白消安和环磷酰胺。白消安静注剂量为0.898 mg·kg~(-1)。按照非临床药代动力学采血时间设计原则,设置采血点,于犬一侧前肢静脉埋入留置针采血,血样经蛋白沉淀和衍生化后进样分析,测定白消安血药浓度,采用非隔室模型,通过药动学软件DAS3.2计算Cy预处理组和Bu/Cy同时组的药动学参数,分别与Bu单独静注组的药动学参数进行比较。并且测定Cy预处理组和Bu/Cy同时组给药后的GST活性,结合药动学结果,分析环磷酰胺对白消安体内代谢的影响。结果:1.白消安在Beagle犬体内测定的方法学验证经HPLC进样分析,白消安的保留时间为10.2 min,峰形明显,分离较好,且不受血清其他内源性物质的干扰;标准曲线为Y=1.6015C-0.1353,R~2=0.9918,在0.1~3.5mg·L~(-1)范围内线性关系良好;精密度与准确度、萃取回收率和稳定性结果均符合方法学要求。2.白消安在Beagle犬体内静注和口服给药的药动学结果白消安口服给药在(1.00±0.50)h时可达最大吸收,峰浓度为(0.81±0.49)mg·L~(-1)。口服给药的MRT为(2.37±0.84)h,低于静注组的(1.31±0.07)h,提示白消安静注时在体内停留时间较口服时更短。3.白消安和环磷酰胺对体内GST活性的影响利用紫外分光光度法分别测定白消安和环磷酰胺给药前后GST活性,结果显示白消安给药前GST活性为(3.874±0.761)nmol?min~(-1)?mL~(-1),给药后为(4.237±0.778)nmol?min~(-1)?mL~(-1),并无显著性差异。环磷酰胺给药前GST活性为(4.159±0.922)nmol?min~(-1)?mL~(-1),给药后为(7.309±0.612)nmol?min~(-1)?mL~(-1),具有显著性差异,表明环磷酰胺能够诱导GST活性,而白消安对GST活性无明显作用。4.白消安和环磷酰胺联用时的药动学及GST活性结果在Cy预处理给药组中,AUC_(0-t)为(1.87±0.07)h·(mg·L~(-1)),相比Bu单独静注组减少了44.5%;MRT为(0.98±0.05)h,低于Bu单独静注组的MRT为(1.31±0.07)h。在Bu/Cy同时给药组中,AUC_(0-t)为(1.66±0.14)h·(mg·L~(-1)),MRT为(0.96±0.08)h,均低于Bu单独静注组,两试验组数据与Bu单独静注组比较,均具有显著性差异。提示白消安和环磷酰胺同时给药后,白消安在体内的消除速度是加快的。Cy预处理给药组和Bu/Cy同时给药组的GST活性均高于Bu单独静注组,表明环磷酰胺通过诱导GST,使其活性提高,从而导致白消安体内代谢加快。结论:1.建立了白消安在Beagle犬体内的HPLC测定方法,该方法准确可靠,灵敏度高且易于操作。2.白消安在Beagle犬体内的药动学结果显示,白消安静注时在体内停留时间较口服时更短。3.确定环磷酰胺可以诱导体内GST活性,而白消安无明显作用;当两种药物同时存在时,受到环磷酰胺对于GST的诱导作用,白消安体内消除加快。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R965
【部分图文】：

山西医科大学硕士学位论文92结果2.1专属性Beagle犬空白血清色谱图见图1-2A，空白血清+IS色谱图见图1-2B，空白血清+IS+白消安标准溶液的色谱图见图1-2C，含药血清+IS色谱图见图1-2D。由图可知，白消安的保留时间是10.2min，IS的保留时间是16.1min，二者峰形明显，血清中的其他内源性物质不干扰白消安的测定。图1-2白消安衍生化测定色谱图A：空白血清；B：空白血清+IS；C：空白血清+IS+Bu；D：含药血清+IS1：Bu衍生化物；2：IS衍生化物；3：DDTC

山西医科大学硕士学位论文102.2标准曲线和定量下限如图1-3所示，白消安在浓度为0.1~3.5mg·L-1的范围内，线性关系良好。求得的标准曲线方程：Y=1.6015C-0.1353，R2=0.9918。使用该方法在HPLC上测得的Beagle犬血清中白消安浓度的定量下限为0.1mg·L-1，RSD=2.8%，n=6。图1-3白消安在Beagle犬血清中测定的标准曲线2.3准确度和精密度准确度和精密度结果见表1-3，该分析方法的日内和日间精密度在1.3%~8.3%之间，均小于15%，准确度在-1.0%~9.5%之间，符合生物样品分析方法的要求。表1-3准确度和精密度（x±SD，n=6）Bu浓度（mg·L-1）日内日间x±SDRSD(%)RE(%)x±SDRSD(%)RE(%)0.20.20±0.012.7-1.00.21±0.014.23.51.01.04±0.098.33.71.10±0.054.69.52.52.51±0.083.30.22.49±0.031.3-0.5

山西医科大学硕士学位论文172结果2.1白消安单剂量静注和单次口服的药-时曲线Beagle犬静脉注射和口服给药的白消安药-时曲线见图2-1。由图可知，Beagle犬静注给药时，血药浓度随时间而降低，在4h后低于定量下限。口服给予白消安时，犬No.1-No.3分别于6h、8h和4h血药浓度低于定量下限，且个体间有较大的差异。图2-1Bu单剂量静注和单次口服给药的药-时曲线（n=3）A：Bu单剂量静注的药-时曲线；B：Bu单次口服的药-时曲线2.2白消安单剂量静注和单次口服的药动学参数Beagle犬静脉注射和口服给药的白消安药动学参数见表2-3。表2-3Bu单剂量静注和单次口服的药动学参数（x±SD，n=3）Bu单剂量静注Bu单次口服AUC0-th·(mg·L-1)3.37±0.181.82±0.45AUC0-∞h·(mg·L-1)4.09±0.532.09±0.41MRTh1.31±0.072.37±0.84#VL·kg-10.50±0.232.26±1.13Cmaxmg·L-11.95±0.210.81±0.49tmaxh0*1.00±0.50*：在静脉注射中，t=0h血药浓度最大；#：与Bu单剂量静注组比较，P<0.05由上表可知，当口服白消安时，在（1.00±0.50）h有最大吸收，达峰浓度为
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本文编号：2892351