低共熔溶剂液相微萃取在中药肉桂酸类衍生物分析中的应用研究

发布时间：2020-11-21 03:03

　　 目的:液相微萃取是在常规液液萃取基础上发展起来的一种新型样品前处理技术,集采样、纯化、富集于一体,并能适应复杂基质、痕量成分、特殊性质成分的分析。为了进一步提高目标化合物的富集效率、减少有机溶剂的用量、提高检测的灵敏度,我们拟对常规的微萃取模式进行改进,以建立更为简单、高效、环境友好的新型液相微萃取方法,结合高效液相色谱法,实现对中药材及其制剂样品中活性成分的纯化、浓集和高效测定。方法:以一种疏水性低共熔溶剂(四丁基氯化铵-己酸)作为萃取相和接受相分别填充于中空纤维的壁孔和管腔;将两根纤维弯成U型浸入中药样品溶液中,于一定温度下对四种肉桂酸类衍生物进行萃取、浓集,结合高效液相色谱-紫外检测技术(HPLC-UVD)完成定量分析。由于纤维壁孔对生物大分子具有分离拦截作用,故将该方法用于血浆样品中活性化合物-蛋白结合率的测定。试验对微萃取和蛋白结合率测定的影响因素进行了优化,对方法的效能指标进行了考察,并对其萃取机制和蛋白结合参数测定机制进行了探讨和阐述。采用自制萃取装置,将四丁基氯化铵和己酸制成的低共熔溶剂作为萃取剂加入样品溶液中,以手摇方式提供分散动力,使低共熔溶剂形成细小液滴,达到与样品溶液的最大接触面积,完成目标化合物的萃取,最后通过离心实现相分离。试验对萃取条件进行了优化,并在最佳条件下进行了方法学考察,结合HPLC-UVD用于川芎和当归药材中肉桂酸类衍生物的分离、浓集和测定,且进行了方法比较。结果:低共熔溶剂中空纤维液相微萃取的最佳萃取条件:萃取剂为1:3摩尔比的四丁基氯化铵-己酸;样品相pH为2、盐浓度为20%;萃取温度为55℃;搅拌速度为800rpm;萃取40 min。此条件下,该方法对四种目标化合物的富集倍数在82-127之间;线性范围分别为:咖啡酸0.002-5.6μg/mL、对羟基肉桂酸0.001-3.2μg/mL、阿魏酸0.0016-4.8μg/mL、肉桂酸0.0012-4μg/mL,相关系数均不低于0.9985,检测限和定量限分别为0.1-0.3和0.4-1.0 ng/mL;日内和日间精密度相对标准偏差分别为1.0%-6.1%和0.7%-6.0%;平均回收率在89.9%-105.2%之间。低共熔溶剂中空纤维液相微萃取结合HPLC-UVD测得川芎药材中咖啡酸和阿魏酸的平均含量分别为64.1±2.4和928.9±27.1μg/g;脉络宁注射液中咖啡酸、对羟基肉桂酸、阿魏酸和肉桂酸的平均含量分别为629.3±10.1、61.1±1.2、23.8±0.8和576.4±16.4μg/mL。此外,活性化合物与血浆蛋白结合时间为90 min,四种目标化合物的血浆蛋白结合率分别为39.3±1.4%、42.0±1.3%、52.9±2.6%和19.8±1.1%。低共熔溶剂分散液相微萃取的最佳萃取条件:萃取剂为150μL的四丁基氯化铵-己酸(1:2,n:n);样品相调节至pH 3、盐浓度15%;萃取15 s后,离心2 min实现相分离。此条件下,该方法对四种目标化合物的富集倍数分别为:咖啡酸135、对羟基肉桂酸171、阿魏酸146、肉桂酸220;线性范围分别为0.02-8μg/mL、0.01-6.4μg/mL、0.016-7.2μg/mL、0.012-7.2μg/mL,相关系数均不低于0.9954,检测限和定量限分别为0.2-0.4和0.6-1.4 ng/mL;日内和日间精密度相对标准偏差分别为1.6%-7.2%和1.3%-8.5%;平均回收率在90.0%-104.6%之间。结合HPLC-UVD测得川芎药材中咖啡酸和阿魏酸的平均含量分别为70.2±4.0和1004.1±40.9μg/g;当归药材中阿魏酸的平均含量为1029.4±17.7μg/g。结论:本文建立了低共熔溶剂中空纤维液相微萃取、低共熔溶剂分散液相微萃取两种新型液相微萃取方法。低共熔溶剂中空纤维液相微萃取使用的新型绿色萃取剂大大提高了传统中空纤维液相微萃取对该类化合物的富集效率,同时还完成了活性化合物-血浆蛋白结合率的测定;低共熔溶剂分散液相微萃取在操作装置和步骤上进行了较大程度的改进,具有操作简便、富集效率高、环境友好等特点。本研究为建立更加绿色环保、简单高效、经济适用的液相微萃取方法,做了积极有效的探索,并已结合HPLC-UVD成功用于复杂样品(中药、血浆)中肉桂酸类质量标志物的萃取、浓集和测定。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R284
【部分图文】：

本研究中的四种肉

山西医科大学硕士学位论文1610空气中晾干；洁净的纤维剪成7cm小段备用。将纤维段放入DES中浸泡15min，待孔隙充满溶液后取出，用纸巾擦除管腔外多余的液体。以注射器将甲醇稀释后的DES（加甲醇以减小DES黏度，比例为15%，v/w）由纤维一端注入腔内，直至另一端有溢出为止，两端用棉线封口。1.2.2DES-HF-LPME测定中药样品含量过程取样品溶液（或混合工作液）700μL、25%NaCl溶液5.6mL置于10mL样品瓶中，用0.1mol/L的盐酸调节pH至2，放入磁力搅拌子。取两根上述已制备好的纤维段，将其弯成U形，浸入样品相中，于磁力搅拌器上55℃水浴800rpm下萃取40min。萃取完成后取出纤维，用吸水纸拭去纤维外壁多余的溶液，剪掉两端封口，用微量注射器将腔内的DES转移到0.5mL的EP管中，再分别用20μL甲醇吹洗各个纤维内腔，合并吹洗液，涡旋混匀。取20μL进行HPLC分析。所有萃取试验均一式三份，操作过程见图1-1。图1-1DES-HF-LPME试验过程示意图1.2.3DES-HF-LPME测定活性化合物-血浆蛋白结合率过程取混合工作液700μL、空白血浆300μL置于10mL样品瓶中。同时，取混合工作溶液700μL、10mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.4）300μL加入另一个样品瓶中。两组溶液分别加入磁力搅拌子于37℃水浴下孵育90min，然后用pH2的25%NaCl（w/v）溶液稀释至7mL。两组溶液各放入两根已制备好的纤维段

山西医科大学硕士学位论文18102结果2.1萃取条件优化为获得较高的萃取效率和检测灵敏度，本试验对影响DES-HF-LPME的各条件因素进行了考察和优化。富集倍数（EF）是评价萃取方法对目标化合物富集能力的指标参数，为萃取达平衡后萃取相中目标化合物的浓度（Ce）与样品相中目标化合物的初始浓度（C0）的比值：EF=CeC0。2.1.1萃取剂种类及组成本试验考察了七种不同的疏水性DES：DES1、DES2、DES3、DES4、DES5、DES6、DES7分别对目标化合物EFs的影响。结果如图1-2A所示，DES5（四丁基氯化铵-己酸）对四种目标化合物的富集效率明显高于其他种类的DES，因此选择DES5作为DES-HF-LPME的萃取溶剂。此外，还考察了四丁基氯化铵和己酸在不同摩尔比（3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）的情况下对目标化合物EFs的影响。结果如图1-2B所示，当四丁基氯化铵和己酸的摩尔比为1:3时富集效率最高。图1-2萃取剂种类（A）及比例（B）对目标化合物富集倍数的影响化合物浓度，0.8μg/mL；样品相体积，7mL，pH=2；盐浓度，20%；萃取温度，55℃；搅拌速度，800rpm；萃取40min（n=3）
【参考文献】

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