砷氟联合暴露诱导H9c2心肌细胞损伤及自噬相关基因的表达变化

发布时间：2020-11-21 06:47

　　 目的:探讨砷氟联合暴露诱导大鼠H9c2心肌细胞损伤及凋亡的特征;阐明自噬在砷氟暴露致心脏毒性过程中的相关机制,以及在此过程中砷和氟之间的互作关系。方法:本研究选取大鼠H9c2心肌细胞作为研究对象。根据2×3析因设计,共分为9组:对照组(0μM NaAsO_2,0mg/L NaF,C组)、高砷高氟组(25μM NaAsO_2,35mg/L NaF,As_(25)F_(35)组)、高砷低氟组(25μM NaAsO_2,10mg/L NaF,As_(25)F_(10)组)、低砷高氟组(10μM NaAsO_2,35mg/L NaF,As_(10)F_(35)组)、低砷低氟组(10μM NaAsO_2,10mg/L NaF,As_(10)F_(10)组)、高氟组(35mg/L NaF,F_(35)组)、低氟组(10mg/L NaF,F_(10)组)、高砷组(25μM NaAsO_2,As_(25)组)、低砷组(10μM NaAsO_2,As_(10)组)。细胞在染毒24h后,1.采取CCK8及MTT方法测定砷氟暴露后细胞的存活率。2.使用倒置显微镜观察砷氟暴露后细胞生长状态、形态及数量的变化。3.通过HE染色在光镜下观察砷氟暴露后细胞的损伤程度。4.使用透射电镜观察细胞内质网、线粒体、自噬体等超微结构的改变。5.采用流氏细胞术测定砷氟暴露后细胞早期、晚期、总凋亡率及胞内ROS的含量。6.采用qRT-PCR法测定自噬相关基因Beclin1、LC3、p62的mRNA表达水平。7.采用Western Blotting测定自噬标志分子Beclin1、LC3-Ⅱ、p62的蛋白表达水平。8.免疫荧光法测定自噬相关蛋白Beclin1、LC3、p62的表达水平。9.采用两因素三水平析因分析判定所有结果中砷与氟之间的交互作用关系。结果:1.砷氟联合暴露后细胞存活率及凋亡率变化:(1)CCK8及MTT结果显示,随着砷氟暴露剂量及染毒时间的增加,细胞存活率逐渐下降。砷氟联合暴露后,细胞存活率由高至低分别为:F_(10)F_(35)As_(10)As_(10)F_(10)As_(10)F_(35)As_(25)As_(25)F_(10)As_(25)F_(35)。其中在暴露24h后,As_(25)F_(35)组、As_(25)F_(10)组的细胞存活率显著低于对照组(p0.001或p0.01)。(2)As_(25)F_(35)组早期凋亡率及总凋亡率最高。2.砷氟联合暴露后细胞生长状态及形态结构变化:(1)镜下观察及HE染色结果显示,氟暴露细胞形态更细长,而砷暴露后细胞体积明显缩小。与对照组相比,As_(25)F_(35)组、As_(25)F_(10)组、As_(25)组细胞排列紊乱,数量减少,细胞生长状况较差。(2)超微结构结果显示,线粒体在砷氟暴露组中出现不同程度的空泡化现象;As_(25)及As_(25)F_(35)组中内质网明显肿胀。3.砷氟联合暴露后细胞氧化损伤指标结果:ROS含量在As_(25)F_(35)组、As_(25)F_(10)组、As_(25)组及F_(35)组中显著升高(As_(25)F_(35)、As_(25)F_(10)、As_(25):p0.001,F_(35):p0.01),而在As_(10)F_(35)组、As_(10)F_(10)组及As_(10)组中ROS含量显著低于对照组(As_(10)F_(35):p0.01,As_(10)F_(10)、As_(10):p0.001)。4.砷氟联合暴露后自噬相关分子表达水平及自噬体超微结构变化:(1)自噬体在As_(25)F_(35)组、As_(25)组、As_(10)组细胞中分布较多,在As_(25)组细胞中,自噬体大都以单层膜自噬溶酶体存在。(2)LC3与p62的mRNA及蛋白表达水平在各组变化趋势相同。其中,p62 mRNA及蛋白表达水平在As_(25)F_(35)组、As_(25)F_(10)组、As_(10)F_(35)组、As_(25)组及As_(10)组均显著升高(p0.01)。LC3mRNA表达在As_(25)F_(35)组、As_(25)F_(10)组和As_(10)F_(35)组显著升高(p0.05),其蛋白水平同样在As_(25)F_(35)组、As_(25)F_(10)组、As_(10)F_(35)组以及As_(25)组中显著升高(As_(25)F_(35)、As_(25)F_(10):p0.001,As_(10)F_(35)、As_(25):p0.05)。Beclin1蛋白表达水平在As_(25)F_(35)组及As_(10)组显著升高(p0.01)。(3)p62及LC3的免疫荧光结果显示,p62荧光半定量蛋白表达水平在As_(25)F_(35)组、As_(25)F_(10)组及As_(25)组中显著升高(As_(25)F_(35):p0.05,As_(25)F_(10)、As_(25):p0.01)。LC3荧光半定量蛋白表达水平在As_(25)F_(35)组显著升高(As_(25)F_(35):p0.05)。5.砷氟联合暴露后析因分析结果:在存活率、总凋亡率、ROS含量、p62 mRNA及蛋白表达水平、Beclin1蛋白表达水平这些指标中,砷和氟存在交互作用,主要表现为拮抗作用。但是两者在Beclin1 mRNA表达水平、p62免疫荧光半定量蛋白、LC3mRNA、蛋白表达水平及免疫荧光半定量蛋白指标中并未发现具有交互作用。结论:砷氟暴露可诱导大鼠H9c2心肌细胞发生损伤。当砷氟浓度均处于高水平时,细胞内线粒体及内质网结构破坏,产生大量ROS,同时升高LC3和p62诱导自噬体生成、抑制自噬溶酶体降解,阻断自噬流,参与了砷氟暴露引发的心脏毒性。在此过程中,砷氟之间可能存在拮抗作用。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R114
【部分图文】：

山西医科大学硕士学位论文82结果2.1砷氟联合暴露下H9c2心肌细胞存活率的测定2.1.1细胞存活率随浓度及时间的变化图1-1A和图1-1B分别表示，在24h及48h染毒时间下，CCK8测定的细胞存活率随砷和氟的染毒浓度的升高而降低。根据细胞存活率不低80%的要求，选定NaAsO2浓度为25μM，NaF浓度为35mg/L作为两元素的高暴露水平，选取10μM及10mg/L作为低暴露水平，并对砷氟不同水平4个组之间进行两两配对形成4个联合组，并选定24h作为染毒时间。图1-1C显示了MTT测定暴露12h、24h、48h、72h和96h后各组细胞存活率的结果。如图所示，随着时间的增加，每个暴露组的细胞存活率均呈下降趋势。各组在各个时间点的存活率由高至低分别为：F10>F35>As10>As10F10>As10F35>As25>As25F10>As25F35。其中As25F35组细胞存活率最低。图1-1砷氟单独及联合暴露对H9c2心肌细胞存活率的影响(x±s,n＝3)

山西医科大学硕士学位论文92.1.2染毒24h后各组细胞存活率的变化MTT测定染毒24h后各组细胞存活率的变化，由图1-2可知，与对照组相比，As25F35组和As25F10组染毒24h后心肌细胞存活率显著降低，差异具有统计学差异（p<0.05）。其中As25F35组细胞存活率为66.2%，As25F10组为75.4%。图1-2砷氟单独及联合暴露24h后H9c2心肌细胞的存活率(x±s,n＝3)2.2流式细胞术测定砷氟联合暴露下的细胞凋亡率通过流式细胞术，测定各组细胞的凋亡率，反映砷氟联合暴露24h后H9c2心肌细胞的存活状况。结果显示（图1-3），细胞的凋亡率随着砷氟浓度的升高而升高。与对照组相比，各染毒组早期凋亡细胞数量明显增加，且具有统计学差异（p<0.05或p<0.01或p<0.001）。其中As25F35组、As25F10组及As25组细胞早期凋亡率较高。而对于晚期凋亡而言，与对照组相比，8个染毒组同样与对照组存在显著性差异（p<0.05或p<0.001），不同的是砷氟单独暴露条件下的晚期凋亡率高于两者联合暴露下的凋亡率，F35组的晚凋率最高。

山西医科大学硕士学位论文10图1-3流式细胞术测定砷氟暴露24h后细胞的凋亡率(x±s,n＝3)2.3砷氟联合暴露下H9c2心肌细胞镜下观察结果如图1-4所示，对照组细胞密集，排列整齐，细胞呈长条状，生长状况良好。As10组细胞体积缩小，排列紊乱；As25组细胞体积明显缩小，凋亡细胞数量多，细胞生长状态差。可见，砷暴露下，H9c2心肌细胞损伤程度较大。F10组无明显差异，而F35组细胞形状更为细长，且凋亡细胞数量较多。砷氟联合暴露情况下，As25F35组与As25F10组细胞生长状态较差，其中As25F35组最严重，细胞形态明显改变，凋亡细胞数量增加，细胞排列紊乱。而As10F10组和As10F35组只有部分凋亡细胞，且与对照组细胞形态差异较校
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 魏星;李文星;;自噬的相关研究进展[J];中华临床医师杂志(电子版);2015年13期

2 曾奇兵;喻仙;杨鋆;洪峰;;氟砷污染对暴露人群骨代谢交互作用[J];中国公共卫生;2012年11期

3 高雅;邢皓;于爱鸣;;自噬与肿瘤[J];中国科技信息;2012年14期

相关博士学位论文 前1条

1 朱传升;三氧化二砷诱导肿瘤细胞自噬及白血病发病机制研究[D];山东大学;2008年

相关硕士学位论文 前3条

1 杨兴;RANK/TRAF-6/NF-κB1通路在氟砷联合染毒成骨与破骨细胞共培养体系中对破骨细胞分化的调控作用[D];贵州医科大学;2019年

2 倪一平;砷致细胞恶性转化过程中核转录因子Nrf2对细胞自噬的作用[D];苏州大学;2018年

3 刘俊青;三氧化二砷诱导白血病细胞株自噬性死亡及其分子机制研究[D];浙江大学;2007年

本文编号：2892692