硫化氢通过硫巯基化MDM2抑制肺上皮细胞的衰老从而改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化

发布时间：2020-11-21 15:17

　　 研究目的肺纤维化是在肺部疾病中常见的一种典型的病理特征。硫化氢(H_2S)被认为是继一氧化氮和一氧化碳之后气体信号分子家族的第三个成员,它在包括炎症,代谢紊乱和血压调节等许多生理和病理生理过程中都起着极其重要的作用。我们前期的实验结果表明,H_2S供体NaHS在在体和离体情况下都可以逆转博来霉素诱导的肺纤维化中发生的细胞衰老从而改善肺纤维化。本研究的目的是深入了解H_2S通过抑制肺泡上皮细胞衰老改善肺纤维化的机制。研究方法构建CBS基因敲除小鼠,通过WB检测肺组织中P53、P21的表达,通过Masson染色观察肺组织纤维化的程度,然后利用免疫荧光观察肺组织中衰老相关蛋白P53、P21和SPC的共染情况。收集经博来霉素干预过的L2细胞的上清液作用于小鼠成纤维细胞(NIH3T3)。运用WB检测成纤维细胞中α-SMA和纤维黏连蛋白(Fibronectin)的蛋白表达,用PCR检测成纤维细胞中增殖特异性基因Aurkb、Ccnb1、Cdc25b和Foxm1 mRNA的表达。为了了解P53在博来霉素诱导的肺纤维化中的关键作用,使用P53抑制剂和硫化氢处理L2细胞,通过检测细胞中的P21蛋白表达和SA-β-gal衰老染色了解细胞衰老的情况。通过免疫共沉淀了解P53和MDM2之间的相互作用以及H_2S处理后P53的泛素化降解情况。最后对经过BLM和H_2S处理过的小鼠肺组织进行硫巯基化处理,明确H_2S的硫巯基化作用。研究结果1)H_2S合成酶CBS敲除使小鼠肺内P53和P21表达增加并诱导肺纤维化;2)H_2S供体NaHS抑制ATII细胞和成纤维细胞之间的相互作用;3)P53抑制剂抑制P53/P21和SASP基因的表达减轻L2细胞衰老;4)H_2S通过硫巯基化增强MDM2和P53的相互作用及P53的泛素化降解。研究结论H_2S可以抑制NIH3T3的异常增殖,并通过使MDM2硫巯基化促进P53泛素化降解来改善细胞衰老从而逆转肺纤维化。
【学位单位】：上海体育学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R563
【部分图文】：

硫化氢通过硫巯基化MDM2抑制肺上皮细胞衰老从而改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化224.统计学分析所有数据以用均值±标准误（SD±SEM）形式表示，使用SPSS20.0分析数据。组间比较运用单因素方差分析（ANOVA）方法，P＜0.05代表有显著性差异，具有统计学意义。5.研究结果5.1H2S合成酶CBS敲除可诱导II型肺上皮细胞衰老和肺纤维化如前所述，博来霉素诱导的肺纤维化中衰老标志物P53、P21的表达随时间延长显著增加，而H2S合成酶CBS和CSE的表达都随时间的表达而减少，这表明博来霉素可以诱导小鼠肺组织细胞的衰老和内源性H2S的减少。为了明确组织的衰老和H2S的减少是否有直接关系，我们构建了CBS敲除小鼠以研究两者之间的关系。在这部分实验中，我们将动物分成两组：野生型组和CBS基因部分敲除两组。图1-1H2S合成酶CBS敲除后肺纤维化形成注：图为是Masson染色（标尺为50um）及气CBS敲除后肺纤维化面积/肺实质面积的比值，与Control相比，**P＜0.01。首先通过Masson染色观察小鼠肺组织纤维化情况。结果表明CBS敲除后肺组织中蓝色胶原沉淀明显增多，肺泡壁的厚度亦明显增加，这表明与野生型小鼠相比，CBS敲除小鼠肺组织的纤维化面积明显增加。

CBS敲除后肺组织中P53/P21/CSE表达变化

硫化氢通过硫巯基化MDM2抑制肺上皮细胞衰老从而改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化24图1-3CBS敲除诱导的小鼠肺组织衰老注：红色荧光标记的是SPC(Cy3)，绿色荧光标记的是P53/P21(FITC)，蓝色标记为细胞核（DAPI），图中标尺为50um。P53/P21标记ATII细胞与ATII细胞总量比值，**P<0.01.更进一步的免疫荧光结果也显示，CBS敲除的小鼠肺组织中P53和P21的含量明显增高。5.2外源性H2S对博来霉素诱导的肺纤维化中P53/P21表达的影响
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本文编号：2893201