整联蛋白β3对血管内皮细胞自噬的影响及其作用机制

发布时间：2020-11-22 01:58

　　 自体动静脉内瘘(native Arteriovenous Fistulae,AVF)是终末期肾病患者进行血液透析的常用建瘘方式,但常因血管内膜增生造成的管腔狭窄而导致失功。血管内皮细胞的功能异常是造成新生内膜增生的重要原因。防止血管内膜增生及术后再狭窄一直是亟待解决的重要课题。整联蛋白β3(Integrinβ3)是一种存在于多种细胞表面的黏附分子,可介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的信号转导,参与调控细胞的自噬、增殖、迁移等生理过程。我们前期的工作已经发现整联蛋白β3可通过影响内皮间质化促进新生内膜增生。自噬是细胞维持稳态的一种自我更新机制,在血管损伤修复过程中发挥重要作用,但内皮细胞自噬异常会诱导内膜增生。然而目前整联蛋白β3是否通过影响内皮细胞自噬而参与内膜增生并不清楚。为了研究整联蛋白β3对自噬的影响及其调控机制,我们收集了临床AVF标本,评估其内膜增生与内皮细胞自噬之间的关系;然后利用人脐静脉内皮细胞(HUVEC),通过诱导HUVEC高表达整联蛋白β3并构建整联蛋白β3敲低细胞,在细胞水平实验研究整联蛋白β3对内皮细胞自噬的影响,并进一步对参与调控自噬的相关信号分子进行了检测;最后,我们还研究了二甲双胍对内皮细胞自噬的作用及其调节机制。结果如下:1.内膜严重增生的AVF中内皮细胞自噬相关分子呈高表达。HE染色结果显示,靠近瘘口部位静脉内膜明显增厚;免疫荧光检测结果显示,增厚的血管内膜内皮细胞LC3高表达。2.整联蛋白β3促进内皮细胞自噬。Realtime-PCR和Western Blot结果显示,TGFβ1诱导整联蛋白β3表达,细胞自噬标志分子LC3Ⅱ和Beclin-1表达也升高;整联蛋白β3敲低后,LC3Ⅱ和Beclin-1的mRNA和蛋白水平均明显下降。3.整联蛋白β3通过YAP信号调节自噬。Western Blot结果显示,整联蛋白β3表达增加或敲低情况下,Notch信号转录因子NICD、AKT、pAKT、pJNK表达变化不明显;整联蛋白β3敲低可下调细胞中Hippo信号通路中YAP(Yes-Associated Protein)YAP及其下游转录因子CTGF、LC3Ⅱ表达水平,表明整联蛋白β3可能通过抑制YAP信号阻止内皮细胞自噬;4.二甲双胍通过抑制YAP表达,促进YAP失活降低内皮细胞自噬水平。CCK-8结果表明,10、20、40mmol/L二甲双胍处理24h均可降低细胞存活率;电镜、免疫荧光及Western Blot结果表明,二甲双胍可阻止细胞中自噬体形成,降低LC3II、Belin-1、CTGF表达,促进YAP磷酸化水平。我们的研究表明整联蛋白β3可能通过促进Hippo通路中的YAP引起内皮细胞自噬,敲低或抑制整联蛋白β3的表达能够抑制细胞自噬,可能对内皮细胞起到保护作用,但还需要在动物模型上进一步验证。本研究加深了我们对调控血管内皮细胞自噬分子机制的理解,也为临床上防控血管内膜增生提供了新的靶点及实验参考。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R692.5
【部分图文】：

重庆医科大学硕士研究生学位论文153结果3.1AVF术后静脉端血管内膜增生HE染色的血管标本切片置于切片数字扫描仪下扫描，可见与相对远离瘘口的部位相比，相对靠近瘘口的部位静脉内膜增厚更明显，管腔受堵严重（图1AB）。图1HE染色观察人AVF术后静脉端血管内膜增生情况（20×）Figure1.ObservationofintimalhyperplasiainhumanveinafterAVFbyHEstaining(20×)（A.靠近瘘口处静脉；B.远离瘘口处静脉）3.2AVF术后内皮细胞中LC3的检测免疫荧光检测的结果显示，位于增厚的血管内膜最内侧的内皮层中，LC3的表达较强；在增生的内膜中，观察到SMAα的广泛表达（图2）。图2免疫荧光染色观察人AVF术后静脉端LC3的表达情况（上200×，下400×）Figure2.ImmunofluorescencestainingwasusedtoobservetheexpressionofLC3inhumanveinafterAVF(upper200×,lower400×)

重庆医科大学硕士研究生学位论文153结果3.1AVF术后静脉端血管内膜增生HE染色的血管标本切片置于切片数字扫描仪下扫描，可见与相对远离瘘口的部位相比，相对靠近瘘口的部位静脉内膜增厚更明显，管腔受堵严重（图1AB）。图1HE染色观察人AVF术后静脉端血管内膜增生情况（20×）Figure1.ObservationofintimalhyperplasiainhumanveinafterAVFbyHEstaining(20×)（A.靠近瘘口处静脉；B.远离瘘口处静脉）3.2AVF术后内皮细胞中LC3的检测免疫荧光检测的结果显示，位于增厚的血管内膜最内侧的内皮层中，LC3的表达较强；在增生的内膜中，观察到SMAα的广泛表达（图2）。图2免疫荧光染色观察人AVF术后静脉端LC3的表达情况（上200×，下400×）Figure2.ImmunofluorescencestainingwasusedtoobservetheexpressionofLC3inhumanveinafterAVF(upper200×,lower400×)

重庆医科大学硕士研究生学位论文22细胞，利用WesternBlot方法检测siRNA处理后整联蛋白β3的表达情况，结果显示，第三种siRNA的敲低效果最好（图3，P<0.001），故后续实验中均使用此敲低细胞（Integrinβ3KD）。图3整联蛋白β3敲低细胞的鉴定Figure3.IdentificationofIntegrinβ3knockdownHUVECcellsA．WesternBlot检测siRNA处理后Integrinβ3的表达情况B.WesternBlot条带量化分析（a：与Scr组比较，P<0.001）3.2整联蛋白β3对自噬相关分子mRNA表达水平的影响Realtime-PCR的结果显示，经TGFβ1处理后，HUVEC中整联蛋白β3、Beclin-1和LC3的mRNA表达明显升高（P<0.05，图4）；而在Integrinβ3敲低的HUVEC中，上述三个分子的mRNA水平则显著下调（P<0.05，图4）。图4Integrinβ3敲低对自噬相关分子mRNA表达水平的影响Figure4．EffectofIntegrinβ3knockdownonmRNAexpressionofautophagy-relatedmoleculesA．Integrinβ3mRNA的相对表达量B．Beclin-1mRNA的相对表达量C．LC3mRNA的相对表达量（a：与ctl组比较，P<0.05；b：与TGF组比较，P<0.05）
【参考文献】

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1 Yang Yuan;Xiangnan Zhang;Yanrong Zheng;Zhong Chen;;Regulation of mitophagy in ischemic brain injury[J];Neuroscience Bulletin;2015年04期

2 王宁;段维勋;杨阳;李悦;梁振兴;金振晓;易定华;俞世强;;γ-分泌酶抑制剂对姜黄素后处理心肌保护作用的影响[J];山东医药;2013年06期

本文编号：2893929