丹参酮ⅡA磺酸钠对X射线诱导心脏成纤维细胞损伤的保护作用及相应机制的体外研究

发布时间：2020-11-21 15:44

　　 目的本研究旨在探讨X射线对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)的影响,以及丹参酮ⅡA磺酸钠(sodium tanshinone ⅡA sulfonate,STS)是否在以上过程中有作用及其可能的分子机制。方法使用差速离心法从Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠中提取CFs,免疫荧光法鉴定CFs的蛋白分子标记后,用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养细胞。细胞随机分组后,分别经0.5、1、2、4Gy的X射线照射处理,克隆形成实验测定细胞克隆数目并确定X射线造成细胞损伤模型的放射剂量。细胞用不同的STS浓度(2.5、5、10、20μg/mL)预处理,MTT法分析STS对CFs的增殖作用。微孔板法测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出量确定X射线对CFs的损伤作用以及STS对CFs的保护作用。确定细胞分组:空白对照0+0组;4+0组;4+2.5组;4+5组;4+10组;4+20组。流式分析测定活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,微孔板法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平含量来确定细胞氧化状态。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞上清液中B型尿钠肽(brain natriuretic peptide,BNP),血管生成素-2(angiotensin II,Ang II)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平。流式细胞术检测细胞周期和凋亡。Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白及p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路相关蛋白表达水平。结果1.细胞纯度鉴定:用免疫荧光鉴定CFs,波形蛋白抗原表达为阳性,细胞纯度为97.5%±1.3%。2.细胞克隆形成实验:与对照组相比,经照射后的CFs克隆形成率呈剂量依赖性明显降低(P0.05);其中经4Gy照射后细胞形成克隆数目最低(P0.05)。3.细胞活力检测:MTT测定结果表明,与对照组相比,STS预处理24h、48h(2.5、5、10、20μg/mL)细胞活力均增加(P0.05),48h、20μg/mL STS预处理后细胞活力增加最显著(P0.05)。LDH测定结果表明,随着放射剂量增加,LDH漏出量呈剂量依赖性明显增高(P0.05);与4+0放射组相比,STS预处理组(2.5、5、10、20μg/mL)LDH含量明显降低(P0.05);与0+0组相比,STS预处理后LDH含量差异无统计学意义(P0.05)。4.氧化损伤相关检测:与0+0组相比,4+0组SOD含量明显降低,ROS阳性率明显升高(P0.05);与4+0组相比,STS预处理组(4+5、4+10、4+20)SOD升高,ROS阳性率降低(P0.05)。与0+0组相比,4Gy X射线照射后MDA含量降低,STS预处理后MDA含量降低,但差异无统计学意义(P0.05)。5.细胞分泌水平检测:与0+0组相比,4+0组Ang II、BNP水平增加(P0.05),STS预处理后Ang II水平呈剂量依赖性降低(P0.05),BNP水平从4+5组开始降低,4+20组显著降低(P0.05)。VEGF水平在X射线与STS干预后差异无统计学意义(P0.05)。6.流式细胞术检测细胞周期和凋亡:与0+0组相比,4+0组S期细胞周期阻滞;与4+0组相比,STS预处理组S期细胞比例降低,其中4+5组、4+10组、4+20组差异有统计学意义(P0.05);与0+0组相比,4+0组细胞凋亡增加,STS预处理后,细胞凋亡率显著降低,4+5组、4+10组、4+20组差异有统计学意义(P0.05),4+20组与0+0组相比差异无统计学意义(P0.05)。7.Western blot检测相关蛋白表达量:与0+0组相比,X射线导致p38,B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(B cell lymphoma/leukmia-2 associated X protein,Bax),caspase-3的表达增加以及B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukmia-2,Bcl-2)的表达减少,磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)蛋白表达显著下调(P0.05);与4+0组相比,STS预处理组caspase-3、Bax/Bcl-2、p-p38蛋白相对表达量显著下调,p-ERK 1/2蛋白表达显著上调(P0.05)。结论X射线可引起CFs损伤,而STS对X射线引起的细胞损伤有保护作用。X射线增加CFs的氧化应激和细胞凋亡,改变细胞周期,其潜在机制可能与Ang II和BNP的分泌减少以及p38 MAPK信号通路激活、凋亡相关蛋白表达增加有关。STS通过抑制上述分子变化减轻X射线对的CFs损伤,并且CFs可能是心血管药物多效性作用的重要靶点,具体机制需要进一步研究。
【学位单位】：甘肃中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

丹参酮ⅡA磺酸钠对X射线诱导心脏成纤维细胞损伤的影响及机制的体外研究19表7LDH漏出量评估X射线辐射和STS治疗对CFs损伤以及保护作用Doseofradiation(Gy)+STSconcentrations(μg/mL)TherelativecontentofLDHrelease(M±SD)AdjustedPValue0+01.01±0.1540.5+01.95±0.104<0.0001*1+02.10±0.170<0.0001*2+02.67±0.093<0.0001*4+02.89±0.128<0.0001*4+2.52.25±0.072<0.0001#4+51.86±0.121<0.0001#4+101.28±0.015<0.0001#4+201.03±0.006<0.0001#,>0.9999*注：*，与0+0对照组相比;#，与4+0组相比；P<0.05,表示差异有统计学意义；LDH，乳酸脱氢酶。注：*P<0.05，**P<0.01与对照组24h相比；#P<0.05，##P<0.01与对照组48h相比；※P<0.0524h与48h相比。图2MTT法检测STS对细胞活力的影响

丹参酮ⅡA磺酸钠对X射线诱导心脏成纤维细胞损伤的影响及机制的体外研究21注：**P<0.01与0+0对照组相比;##P<0.01与4+0组相比;NS,差异无统计学意义。LDH，乳酸脱氢酶。图4LDH漏出量评估X射线辐射和STS治疗对CFs损伤以及保护作用4.结论X射线可诱导CFs损伤，STS对CFs有保护作用，同时后续实验选择4GyX射线建立CFs的放射损伤模型。

丹参酮ⅡA磺酸钠对X射线诱导心脏成纤维细胞损伤的影响及机制的体外研究34注：**P<0.01与0+0对照组比较；#P<0.05and##P<0.01与4+0组比较；NS：差异无统计学意义。AngⅡ，血管紧张素II；BNP，B型尿钠肽；VEGF，血管内皮生长因子。（A）AngII分泌水平，（B）BNP分泌水平，（C）VEGF分泌水平。图6X射线照射对CFs分泌水平的影响以及STS干预后的改变
【参考文献】

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本文编号：2893234