斑马鱼Ppm1g蛋白AD结构域敲除实验模型的建立及相关生物学功能初步分析
发布时间：2020-12-06 10:35
在人类疾病中,神经系统性疾病的发生越来越频繁,而绝大多数疾病的致病机制尚不清楚,加上治疗手段有限,这导致患者及其家庭深受痛苦,因此,对于基础研究领域而言,可以利用模式生物构建与人类疾病相关的实验模型,同时结合分子生物学的手段来研究某些神经发育相关因子的生物学功能或探讨相关疾病的致病机理,这将对临床上神经系统疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。斑马鱼凭借胚胎透明、体外受精和体外发育等优势,深受研究者的喜爱,日益成为了神经生物学及相关疾病研究等领域的一种理想模式动物。基因编辑技术的迅猛发展与应用,CRISPR/Cas9技术也应运而生,国内外利用CRISPR/Cas9技术和模式动物斑马鱼进行神经系统疾病模型相关研究,取得了重要进展,同时促进了神经系统研究领域的发展。PP2C蛋白磷酸酶是一类金属依赖性磷酸酶家族,PPM1G作为该家族成员之一,除了包含与该家族成员相同的部分结构域外,在该蛋白序列的第138至157氨基酸残基包含一个高度保守的特异结构域,即酸性结构域（Acidic Domain,AD）。也有研究表明,小鼠Ppm1g基因的敲除导致敲除鼠出现了神经发育异常的突变表型;但对于PPM1G蛋白...
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
斑马鱼胚胎神经胚层早期发育模式
斑马鱼PPM1G蛋白AD结构域敲除实验模型的建立及相关生物学功能初步分析5图1-2CRISPR/Cas9技术原理图（引自李君，遗传，2013）1.5PPM1G的研究现状PP2C（ProteinPhosphatase2C,PP2C）是一类金属依赖性磷酸酶家族，PP2C家族成员包含PP2Cα、PP2Cβ和PP2Cγ（又称PPM1G）。PPM1G（ProteinPhosphatase,Mg2+/Mn2+Dependent,1G）与PP2Cα和PP2Cβ序列较保守，且其具有一个特异的酸性结构域（AcidicDomian，AD），这是PPM1G别于其PP2C家族成员所特有的一个结构域，同时有关该结构域在生物体内的功能尚未有文献报道[55]。斑马鱼Ppm1g蛋白的编码基因ppm1g位于斑马鱼13号染色体上，具有10个外显子，mRNA全长1488bp，编码496氨基酸。其中，Ppm1g-AD结构域编码序列位于第5个外显子，包含60bp，编码20个氨基酸。在斑马鱼中，Foster等人对ppm1g的表达进行了分析，如图1-3所示，研究发现ppm1g主要在大脑，脊髓，眼睛和鳃弓等位置高表达；随后，Foster等人通过MO技术敲低斑马鱼ppm1g基因的表达，导致斑马鱼出现了中枢神经系统异常、头部较小且中脑充气不足等突变表型。与此同时，研究者通过CRISPR/Cas9技术构建鼠Ppm1g敲除品系，发现敲除鼠中出现了颅面缺陷、神经管闭合失败等突变表型[56]。在体外HeLa细胞中，通过siRNA来干扰细胞内ppm1g的表达，检测到细胞内不仅出现了PPM1G蛋白量大量减少，同时细胞的增殖速率下降了约三倍。此外，研究者发现PPM1G蛋白磷酸酶能够使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27发生去磷酸化作用，以此来调控细胞周期的进展[57]。通过免疫共沉淀实验，研究者发现PPM1G蛋白能够结合组蛋白H2A和H2B，但缺失酸性结构域AD后却无法与之结合；同时，对于磷酸化的组蛋白H2A和H2B，
ppm1g表达分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]One-step generation of zebrafish carrying a conditional knockoutknockin visible switch via CRISPR/Cas9-mediated intron targeting[J]. Jia Li,Hong-Yu Li,Shan-Ye Gu,Hua-Xing Zi,Lai Jiang,Jiu-Lin Du. Science China(Life Sciences). 2020(01)
[2]模式生物斑马鱼在中药药效物质筛选中的应用进展[J]. 王成,龚莉虹,郭朝成,何林峰,赵兴桃,李芸霞. 中草药. 2019(24)
[3]成都地区脑性瘫痪患儿422例伴发小头畸形临床分析[J]. 马丹,王秋,罗蓉,赵金桂,王芳芳,李娜. 中国实用儿科杂志. 2019(01)
[4]重视儿童神经发育障碍性疾病的病因及临床研究[J]. 彭镜,尹飞. 中国医师杂志. 2018 (09)
[5]自闭症谱系障碍的免疫学研究进展[J]. 金靖谊,时小燕. 河南大学学报(医学版). 2018(02)
[6]Mecp2在斑马鱼胚胎神经发育中对NOTCH信号通路的调控[J]. 何丽番,高海. 生物技术通报. 2016(04)
[7]基因修饰技术研究进展[J]. 张白雪,孙其信,李海峰. 生物工程学报. 2015(08)
[8]线粒体功能缺陷和神经系统疾病[J]. 米慧,林蓓,管敏鑫. 生命科学. 2012(06)
本文编号：2901229
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
斑马鱼胚胎神经胚层早期发育模式
斑马鱼PPM1G蛋白AD结构域敲除实验模型的建立及相关生物学功能初步分析5图1-2CRISPR/Cas9技术原理图（引自李君，遗传，2013）1.5PPM1G的研究现状PP2C（ProteinPhosphatase2C,PP2C）是一类金属依赖性磷酸酶家族，PP2C家族成员包含PP2Cα、PP2Cβ和PP2Cγ（又称PPM1G）。PPM1G（ProteinPhosphatase,Mg2+/Mn2+Dependent,1G）与PP2Cα和PP2Cβ序列较保守，且其具有一个特异的酸性结构域（AcidicDomian，AD），这是PPM1G别于其PP2C家族成员所特有的一个结构域，同时有关该结构域在生物体内的功能尚未有文献报道[55]。斑马鱼Ppm1g蛋白的编码基因ppm1g位于斑马鱼13号染色体上，具有10个外显子，mRNA全长1488bp，编码496氨基酸。其中，Ppm1g-AD结构域编码序列位于第5个外显子，包含60bp，编码20个氨基酸。在斑马鱼中，Foster等人对ppm1g的表达进行了分析，如图1-3所示，研究发现ppm1g主要在大脑，脊髓，眼睛和鳃弓等位置高表达；随后，Foster等人通过MO技术敲低斑马鱼ppm1g基因的表达，导致斑马鱼出现了中枢神经系统异常、头部较小且中脑充气不足等突变表型。与此同时，研究者通过CRISPR/Cas9技术构建鼠Ppm1g敲除品系，发现敲除鼠中出现了颅面缺陷、神经管闭合失败等突变表型[56]。在体外HeLa细胞中，通过siRNA来干扰细胞内ppm1g的表达，检测到细胞内不仅出现了PPM1G蛋白量大量减少，同时细胞的增殖速率下降了约三倍。此外，研究者发现PPM1G蛋白磷酸酶能够使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27发生去磷酸化作用，以此来调控细胞周期的进展[57]。通过免疫共沉淀实验，研究者发现PPM1G蛋白能够结合组蛋白H2A和H2B，但缺失酸性结构域AD后却无法与之结合；同时，对于磷酸化的组蛋白H2A和H2B，
ppm1g表达分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]One-step generation of zebrafish carrying a conditional knockoutknockin visible switch via CRISPR/Cas9-mediated intron targeting[J]. Jia Li,Hong-Yu Li,Shan-Ye Gu,Hua-Xing Zi,Lai Jiang,Jiu-Lin Du. Science China(Life Sciences). 2020(01)
[2]模式生物斑马鱼在中药药效物质筛选中的应用进展[J]. 王成,龚莉虹,郭朝成,何林峰,赵兴桃,李芸霞. 中草药. 2019(24)
[3]成都地区脑性瘫痪患儿422例伴发小头畸形临床分析[J]. 马丹,王秋,罗蓉,赵金桂,王芳芳,李娜. 中国实用儿科杂志. 2019(01)
[4]重视儿童神经发育障碍性疾病的病因及临床研究[J]. 彭镜,尹飞. 中国医师杂志. 2018 (09)
[5]自闭症谱系障碍的免疫学研究进展[J]. 金靖谊,时小燕. 河南大学学报(医学版). 2018(02)
[6]Mecp2在斑马鱼胚胎神经发育中对NOTCH信号通路的调控[J]. 何丽番,高海. 生物技术通报. 2016(04)
[7]基因修饰技术研究进展[J]. 张白雪,孙其信,李海峰. 生物工程学报. 2015(08)
[8]线粒体功能缺陷和神经系统疾病[J]. 米慧,林蓓,管敏鑫. 生命科学. 2012(06)
本文编号：2901229
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