心房颤动患者血浆外泌体提

发布时间：2020-12-09 06:03

　　目的:基于高通量测序技术探讨微小RNA（miRNA）在窦性心律（Sinus Rhythm,SR）及心房颤动（Atrial fibrillation,AF）患者血浆外泌体中的表达差异,寻找可能和房颤发生发展密切相关的潜在标志物,初步探索其生物学作用。方法:1.本研究筛选2018-06至2019-06至某院就诊的患者为研究对象,其中房颤组（AF Group）患者26人,窦性心律组（SR Group）23人,统计临床资料,根据房颤发作持续时间分为阵发性心房颤动组（Paroxysmal AF Group,PaAF,n=13）及持续性心房颤动组（Persistent AF Group,PeAF,n=13）。2.提取血浆外泌体,透射电子显微镜观察外泌体形态,粒径检测,蛋白印迹法（Western Blot,WB）检测表面标志蛋白。3.每组随机选取3例,采用高通量测序技术获取外泌体miRNA差异表达谱,查找文献,采用生信学分析筛选出和心血管疾病相关的目标miRNA。4.对SR组（n=20）及AF组（n=20）患者,应用实时荧光定量技术（qPCR）验证目标miRNA,使用受试者工作特征曲线（Receiv... 

【文章来源】：蚌埠医学院安徽省

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

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外泌体粒径分析图

142.2外泌体粒径检测每例样本进行三次实验，分析结果取三次平均值，粒径分析图如图2所示。如表4所示，3组见平均粒径和粒径范围百分比在相同水平上，直径在30-150nm占所有囊泡83%左右，直径在30-200nm占所有囊泡90%左右，说明获得的囊泡直径较均一，纯度较高。表4各组外泌体粒径分析结果Tab.4Resultsofexosomalparticlesizeanalysisineachgroup注：此标本粒径主峰为50nm，次峰值为150nm图2外泌体粒径分析图Fig.2Analysisofexosomalparticlesize2.3外泌体表面标志蛋白结果在SR组、PaAF组、PeAF组随机抽选的样本1例，编号分别为：2317、2323、2330。采用WB法检测外泌体表面标记蛋白：CD9、CD63、TSG101。3组间CD9、CD63、TSG101均有条带，说明纯化所得为外泌体。组别平均粒径粒径主峰(nm)30-150nm百分比(%)30-200nm百分比(%)SR组93.348.781.7291.89PaAF组9350.385.9493.13PeAF组88.947.082.2889.55图3外泌体标志蛋白Westernblot结果Fig.3Westernblotresultsofexosomalmarkerproteinsineachgroup

153数据质控本项目使用BGISEQ-500平台共测了9例样品，每例样品平均产出24.54M数据，共检测到3280个miRNA。样品比对基因组的平均比对率为86.59%。计算样品间所有基因表达量的Pearson相关系数并绘制热图，如图4所示，3组内基因表达量Pearson相关系数均>0.8，说明组内样品间基因表达水平相似。将每个标本cleanreads比对到参考基因组序列，结果如表5所示，比对基因组占比最低为标本SR3，为79.01%，说明获取的cleanreads质量较高。如图5所示，长度在21-22nt的RNA有一小峰值，表明我们提取的小RNA中miRNA序列纯度较高。注：X、Y轴均代表每个样品；颜色代表相关性系数(颜色越深代表相关性越高，颜色越代表相关性越低)；0.8-1.0极强相关；0.6-0.8强相关。图4各组基因表达量相关性热图Fig.4Correlationheatmapofgeneexpressionineachgroup注：X轴表示小RNA长度(测序得到的片段去除接头后的长度)，Y轴表示该长度小RNA占所有小RNA数量百分比。该图反映直接测序得到的小RNA长度分布情况。图5各组小RNA长度分布图Fig.5DistributionofsmallRNAlengthsineachgroup


本文编号：2906403