JAK2 exon12与CALR基因共突变一例ET患者的克隆分析及对JAK2 exon12不典型新突变的功能研究

发布时间：2020-12-18 06:47

　　目的:Ph染色体阴性的经典骨髓增殖性肿瘤（MPN）以红系、粒系和巨核系中一系或多系髓细胞过度增殖为主要特征,是一种恶性血液肿瘤疾病。临床上主要以真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）和原发性骨髓纤维化（PMF）多见。目前,研究证实MPN的主要分子病因包括JAK2、MPL和CALR基因突变,在MPN疾病中相互排斥发生。其中,JAK2基因突变见于95%的PV患者,突变类型主要为JAK2 V617F和JAK2 exon12。MPLW515是最常见的MPL基因突变类型,仅见于1%-10%的ET和PMF患者。CALR基因的突变热点位于9号外显子,主要表现为两种突变类型（52-bp缺失和5-bp插入）,主要见于ET和PMF患者。其余未检测到上述三种驱动基因主要热点突变的MPN称为“三阴性”MPN（TN-MPN）,主要见于15%的ET和低于10%的PMF患者。近年来,研究者在少数MPN患者中发现了驱动基因双突变的患者,以JAK2 V617F和CALR基因共突变多见,可见于PV、ET及PMF患者。临床工作中我们首次发现JAK2 exonl2（JAK2 N533S不典型突变）和CALR（5... 

【文章来源】：山西医科大学山西省

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【学位级别】：硕士

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JAK2N533S和CALRtype1双突变患者初诊的临床结果

山西医科大学硕士学位论文182.2临床水平分析患者JAK2N533S和CALRtypeⅠ型共突变的克隆关系2.2.1BFU-E和CFU-G集落形成图提取患者新鲜外周血中单个核细胞，用DMEM基础培养基将提取的单个核细胞稀释成1×102cells/mL的细胞密度，轻柔吹打混匀成单细胞悬液，用有限稀释法培养获取单细胞克隆，然后挑取单细胞克隆，分别用含3U/mlrhEPO和100ng/mlrhG-CSF的甲基纤维素培养基培养单细胞克隆15天，诱导形成暴发型红系集落形成单位（BFU-E）和粒细胞集落形成单位（CFU-G），结果如下：图2BFU-E和CFU-G集落形成图(X10)2.2.2BFU-E及CFU-G单个集落JAK2N533S和CALR-typeⅠ型突变检测结果我们共挑取了17个BFU-E集落和21个CFU-G集落，并提取每个集落细胞的DNA，用相应引物对JAK2exon12和CALRexon9进行PCR扩增，然后取10ul扩增产物进行一代测序。我们用九格图对测序结果进行描述分析，九格图的横轴从左到右依次为CALR野生型（WT）、CALRtypeⅠ型杂合型（Het）和纯合型（Hom），纵轴自上而下依次为JAK2N533S纯合型（Hom）、杂合型（Het）和野生型（WT）。我们用一个点表示一个集落，红点代表BFU-E集落，蓝点代表CFU-G集落，用每个点在九格图的位置代表检测结果。具体结果如下：

山西医科大学硕士学位论文19①挑取的17个BFU-E集落，经检测全部携带JAK2N533S杂合突变，14个(82%)集落携带CALRtype1杂合突变，2个(12%)集落为CALR野生型，1个(6%)集落检测到CALRtype1纯合突变。②挑取的21个CFU-G集落，经检测均存在JAK2N533S杂合突变，20个(95%)集落携带CALRtype1杂合突变，1个(5%)集落为CALR野生型。图3BFU-E及CFU-G单个集落JAK2N533S和CALR-typeⅠ型突变检测结果图（左上：BFU-E集落测序结果分析九格图右上：BFU-E集落测序峰图左下：CFU-G集落测序结果分析九格图右下：CFU-G集落测序峰图）2.2.3患者毛囊DNA中JAK2N533S和CALR基因突变检测的结果我们在红系及粒系所有集落中均检测出JAK2N533S杂合突变，推测该突变可能为胚系突变。因此，我们通过提取该患者的毛囊DNA，检测JAK2N533S及CALR基因突变情况并进行一代测序，结果发现JAK2N533S杂合突变仍为阳性，而CALR基因为野生型，从而验证了JAK2N533S突变为胚系突变。JAK2N533S和CALR基因测序峰图如下：


本文编号：2923561