针对MPN中JAK2、MPL、CALR突变对NAP表达的影响进行人NB4细胞系中磷酸化修饰的TMT标记定量蛋白组学研究

发布时间：2021-01-01 03:28

　　目的:目前研究表明,MPN在临床上最常见的突变有三种,即JAK2、MPL、CALR,被称为“驱动基因”。前期我们课题组研究发现,JAK2V617F患者的体内的中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）升高,而MPL、CALR患者体内的中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）降低,但其调控机制还不清楚。本研究通过将TMT标记、高效液相色谱分级技术、磷酸化肽段的富集技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列蛋白组学分析,对NB4-JAK2V617F、NB4-MPLW515L、NB4-CALR type1和NB4-MSCV细胞系的全蛋白使用TMT标记后,对磷酸化修饰定量组学进行分析,对比磷酸化差异蛋白在突变基因细胞系与空载对照细胞系内的表达情况,比较分析各突变导致NAP不同改变的可能关键通路调控分子。方法:构建稳定表达JAK2V617F、MPLW515L、CALR type1突变基因以及空载体对照组基因NB4细胞模型后,本研究通过蛋白提取、胰酶酶解、TMT标记、高效液相色谱（HPLC）分级、亲和富集、液相色谱-质谱串联分析、数据库搜索、生物信息学分析方法,对样本中的磷酸化定量组学进行差异分析。结果:本研究通过蛋... 

【文章来源】： 赵晓雪 山西医科大学

【文章页数】：87 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

pCDH1-MSCV-MCS1-T2A-copGFP慢病毒表达载体的质粒模式图

山西医科大学硕士学位论文23JAK2V617FMPLW515LCALRtype1图2-2各突变基因慢病毒载体测序结果2.2各突变基因NB4细胞模型的鉴定将已经测序鉴定无误后的JAK2V617F、MPLW515L、CALRType1、MSCV空载体分别与慢病毒包装质粒转染293T，培养48h后，激光共聚焦显微镜观察GFP表达量，各组细胞均有绿色荧光表达。收集慢病毒悬液并感染NB4细胞株,培养72h后,收取适量细胞，进行流式细胞术检测，得到各组NB4细胞株感染率（GFP阳性率）依次为MSCV（96.2%），JAK2V617F(99.4%),MPLW515L(99.1%),CALRtype1（98.4%），流式检测结果图2-3：Type1:del52bp

山西医科大学硕士学位论文24图2-3各突变基因慢病毒载体构建NB4细胞模型流式检测GFP表达量2.3对NB4-JAK2V617F（简称NB4-JAK2V617F），NB4-MPLW515L（简称NB4-MPLW515L）,NB4-CALRtype1（简称NB4-CALRtype1）以及NB4-MSCV四种人细胞系（3次生物学重复）全蛋白TMT标记定量蛋白质组学研究和生物信息学分析2.3.1质谱质控检测(1)所有鉴定到肽段的长度分布如图2-4所示，大多数肽段分布在7-20个氨基酸中，这符合基于胰蛋白酶消化和HCD片段化的一般规则。由于碎片离子太少，<5个氨基酸的肽段，不能产生有效的序列鉴定。>20个氨基酸肽由于质量和电荷数高，不适合HCD片段JAK2V617FMSCVMPLW515LCALRtype1


本文编号：2950866