低氧预处理OM-MSCs促进HMC-3对α-突触核蛋白自噬清除的研究

发布时间：2021-01-02 19:39

　　目的:近期研究发现间充质干细胞（MSCs）对治疗帕金森病的相关研究取得了一些成果,但是其作用机制未能完全明确。我们通过α-突触核蛋白处理人小胶质细胞系（HMC-3）与神经元细胞系（SH-SY5Y）体外混合培养,模拟帕金森患者黒质纹状体中神经元细胞所处的免疫环境;利用低氧预处理的嗅黏膜间充质干细胞（OM-MSCs）与上述细胞共培养,观察HMC-3表型的变化、检测α-突触核蛋白含量、相应免疫因子的变化以及SH-SY5Y的凋亡情况,从而探讨低氧预处理OM-MSCs对α-突触核蛋白的自噬清除机制以及对神经元保护作用。方法:（1）人OM-MSCs获取、培养;利用流式细胞学以及免疫荧光对OMMSCs进行鉴定;（2）利用α-突触核蛋白预处理HMC-3,使其极化;利用低氧装置对低氧组的OM-MSCs进行低氧预处理。（3）利用Transwell小室将HMC-3、SH-SY5Y与OM-MSCs进行体外共培养;（4）共培养后观察各组HMC-3的形态;Western Blot及免疫荧光检测各组HMC-3的α-突触核蛋白、IL-1β、CD206、溶酶体等相关标记物的含量;透射电子显微镜观察各组HMC-3自噬溶酶... 

【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校

【文章页数】：50 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

Transwell装置分组示意图

硕士学位论文14第3章结果3.1OM-MSCs的鉴定3.1.1细胞计数及免疫荧光鉴定在OM-MSCs培养至第四代时，在光学显微镜下可以观察到细胞呈旋涡状生长方式，单个细胞显示出成纤维细胞形态（图3-1A）。自动细胞计数仪显示，一瓶T25培养瓶的细胞数量约为1~2×106，细胞活率在95%以上（图3-1B）。考虑到细胞经过消化、离心等操作的处理，以及细胞计数仪的局限性，细胞的真实活率会更高。进一步根据OM-MSCs表达的标记物进行免疫荧光染色鉴定，OM-MSCs的Nestin、STRO-1均为阳性（图3-1C、D），表明获取的OM-MSCs是一种间充质干细胞。图3-1：第四代OM-MSCs光镜、细胞计数及细胞免疫荧光鉴定A:OM-MSCs光镜下×100；B：细胞计数图像；B：细胞计数图像；C：Nestin荧光染色×400；D：STRO-1荧光染色；×4003.1.2流式细胞学鉴定将第四代的OM-MSCs进行流式学检测，结果显示：OM-MSCs表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD146，且各阳性标记物纯度均在96%以上（图3-2）。OM-MSCs不表达造血干细胞标记物CD34、CD45，但表达MSCs的其他标记物，再次表明OM-MSCs是一种间充质干细胞。

低氧预处理OM-MSCs促进HMC-3对α-突触核蛋白自噬清除的研究15图3-2：第四代OM-MSCs各表面标志物的流式细胞学检测3.2HMC-3的形态我们用小胶质细胞标记物Iba1抗体标记HMC-3胞浆观察细胞形态。细胞荧光显微镜下观察到，对照组的HMC-3核周胞浆紧密，而α-突触核蛋白处理的HMC-3呈现出细长的丝状伪足（图3-3），类似M1型小胶质细胞的极化；相反与OM-MSC的共培养后，HMC-3出现更少的伪足，趋向于M2型的小胶质细胞。图3-3：各组HMC-3的Iba1免疫荧光显示细胞形态×400

【参考文献】：
期刊论文
[1]低氧微环境促进人嗅黏膜间充质干细胞的增殖及其机制[J]. 卓毅,李璇,段答,葛丽特,袁挺,吴沛,王昊,龙浪,卢明.  中国组织工程研究. 2017(33)
[2]人嗅黏膜间充质干细胞的生物学特性[J]. 葛丽特,卓毅,段答,赵振宇,滕晓华,王磊,卢明.  中南大学学报(医学版). 2015(01)
[3]脂肪间充质干细胞在神经修复中的研究进展[J]. 葛丽特,卢明.  中国微侵袭神经外科杂志. 2014(12)
[4]嗅黏膜间充质干细胞在神经修复中的研究进展[J]. 葛丽特,卢明.  国际神经病学神经外科学杂志. 2014(01)

硕士论文
[1]人嗅黏膜间充质干细胞与嗅鞘细胞在鼻黏膜中分布的研究[D]. 黄佩琦.湖南师范大学 2018



本文编号：2953513