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一种优化新生大鼠心肌细胞培养方法及CTRP3保护MIRI作用研究

发布时间:2021-01-12 13:39
  目的(1)对新生大鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs)的分离培养方法进行优化,寻找一种较为高效的新生大鼠心肌细胞分离培养方法;(2)研究CTRP3在心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI)中的作用。方法(1)新生大鼠心肌细胞的分离培养。无菌操作快速取得大鼠乳鼠心脏后以机械处理将心脏剪为心肌组织块;采用两种消化方法分别对心肌组织进行消化:(1)双酶消化法:0.08%胰酶和0.125%胶原酶混合(1:1)消化心肌组织,(2)0.08%胰酶+机械消化法:先用0.08%胰酶消化心肌组织后再以机械消化法消化剩余的心肌组织;用100μm的细胞筛过滤得到的细胞混悬液,然后进行差速贴壁培养;通过台盼蓝染色法检测差速贴壁分离后的细胞数量及存活率,在光学倒置相差显微镜下观察细胞的形态及特征,用共聚焦免疫荧光染色法鉴定新生大鼠心肌细胞的纯度。(2)缺氧/复氧损伤模型构建:应用氮气避氧法(三气培养箱)建立NRCMs缺氧/复氧损伤模型。(3)应用MTT法检测NRCMs对药物(CTRP3)的反应性。(4... 

【文章来源】:延安大学陕西省

【文章页数】:52 页

【学位级别】:硕士

【部分图文】:

一种优化新生大鼠心肌细胞培养方法及CTRP3保护MIRI作用研究


心肌细胞的分离A)迅速取出7只新生大鼠的心脏并在预冷的PBS缓冲液中清洗

细胞,存活率,方法,机械消化


-9-分别收集两组差速贴壁培养后的细胞悬液进行台盼蓝染色,死细胞被染为蓝色,活细胞拒染呈透明色。根据台盼蓝染色结果统计,7只乳鼠分离的心肌组织分别用两种方法消化后得到的细胞数量及细胞存活率如图2所示,双酶消化法获得的细胞数量约为(0.9±0.6)×106个,细胞存活率为(56.6±32.4)%;0.08%胰酶+机械消化法的细胞数量约为(2.2±1.7)×106个,细胞存活率为(93.2±53.6)%。0.08%胰酶+机械消化组细胞数量及存活率均高于双酶消化组(P<0.05)。图2不同消化方法对细胞数量及存活率影响A:细胞台盼蓝染色结果(×10),ⅰ:0.08%胰酶+机械消化法,ⅱ:双酶消化法;B:细胞数量;C:细胞存活率;*p<0.05(n=3)3.2细胞形态学及自发性搏动的观察两组细胞刚接种未贴壁时呈圆形,折光性强。培养12h后NRCMs开始贴壁生长。培养24h后,可观察到部分NRCMs贴壁,伸出伪足,呈菱形、梭形或不规则状,并出现自发性搏动。培养48h后,NRCMs基本都已贴壁,细胞成簇生长,细胞AⅱBCⅰ

机械消化,胰酶,形态学,细胞


-10-簇之间出现更广范围的连接。细胞簇之间开始出现同步搏动且搏动有力,博动频率在50-120次/分钟。培养96h后,显微镜下可观察到视野中的细胞成片状同步搏动,收缩有力。培养12天后,NRCMs开始老化,搏动幅度较前减弱、频率减慢(20-60次/分钟)并伸出更多更长的伪足。差速贴壁分离后,原来的细胞培养皿里的原代成纤维细胞如果需要可继续用于培养及传代。图3细胞形态学观察A)未贴壁的NRCMs(0.08%胰酶+机械消化法,×10);B)培养24h的NRCMs(0.08%胰酶+机械消化法,×10);C)培养48h的NRCMs(0.08%胰酶+机械消化法,×40);D)培养48h的NRCMs(双酶消化法,×40);E)培养12d后NRCMs较前伸出更多更长的伪足(0.08%胰酶+机械消化法,×40);F)培养24h的原代心脏成纤维细胞(0.08%胰酶+机械消化法,×40)。3.3NRCMs活力的观察光学显微镜下随机选取5个视野观察并计数NRCMs的搏动数量,显微镜下观察到双酶消化法组NRCMs搏动率为(62.6±33.6)%,0.08%胰酶+机械消化法组NRCMs搏动率为(92.4±32.4)%。0.08%胰酶+机械消化得到的NRCMs搏动细胞数量百分比高于双酶消化组(图4,P<0.05)。DEBCFA

【参考文献】:
期刊论文
[1]2005~2017年中国疾病负担研究报告[J]. 殷鹏,齐金蕾,刘韫宁,刘江美,李婕,曾新颖,王黎君,周脉耕.  中国循环杂志. 2019(12)
[2]乳鼠心肌细胞可成片生长的分离和培养方法[J]. 黄绍代,陈鹏,吴超,胡丹,彭江,田建伟.  中国组织工程研究. 2017(24)



本文编号:2972949

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