hnRNP E2与宫颈癌变的关系及其结合基因的功能分析
发布时间：2021-01-15 05:45
目的:HPV反复或持续感染是宫颈癌变发生主要但并非唯一的病理因素,寻找其他致癌因子或协同HPV的致癌因素成为目前关注的焦点。核不均一核糖核蛋白E2（hnRNP E2）是存在于细胞核中的一种RNA结合蛋白,其含有的独特KH域具有DNA和RNA的结合位点,为其实现细胞信号转导、基因转录调节、控制mRNA的稳定和翻译等一系列生物学功能提供了前提条件。研究表明,hnRNP E2在众多肿瘤中存在异常高表达,但在宫颈癌变中的表达情况尚无定论。hnRNP E2可以与DNA发生结合,但其在HPV16阳性的Siha细胞中与全基因组DNA的结合尚不明确。此次研究选取不同宫颈病变患者,检测hnRNP E2蛋白表达水平,同时检测HPV16感染情况,探讨hnRNP E2与HPV16在宫颈癌变中的作用及其相互关系;进一步在体外细胞实验中,选择HPV16阳性的Siha细胞为实验媒介,应用ChIP-Seq技术,分析hnRNP E2与全基因组的结合位点以及结合的基因,全面地揭示hnRNP E2结合位点和基因的分布特征,以及对hnRNP E2结合基因进行GO功能分类,对靶基因可能参与的生物信号通路进行预测,从而为宫颈癌病...
【文章来源】： 高雯 山西医科大学
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
研究对象筛选流程图
山西医科大学硕士学位论文12图1-2染色质酶切情况5）测纯化后的DNA浓度，其在50-200μg/mL之间可进行下一步实验。（4）染色质免疫沉淀：1）1个IP反应需含有7-8μgDNA的交联染色质片段，根据DNA浓度，计算其体积，每个样品管中均取10μL出来作为2%输入对照（2%Input），-20°C保存至第（5）的1）中使用。2）向每个实验管中加1.5μgAnti-hnRNPE2抗体；阴性对照管加2μL正常兔IgG;阳性对照管加10μL组蛋白H3RabbitmAb，4℃孵育过夜。3）取30ul蛋白G磁珠加入到每个管中，4°C摇床孵育2小时。4）将离心管放在磁性分离架上，蛋白G磁珠吸附至管壁，溶液澄清后，吸走上清。5）加入1ml低盐漂洗液，取下样品管，4°C摇床孵育5分钟，重复4）和5）两次。（3mL低盐漂洗液：300μL10×ChIPBuffer+2.7mL超纯水）6）加入1ml高盐漂洗液，取下样品管，4°C摇床孵育5分钟，重新至于磁性分离架上，溶液澄清后，吸走上清。（1mL高盐漂洗液：100μL10×ChIPBuffer+900μL超纯水+70μL5MNaCl）（5）将染色体从抗体/蛋白G微珠上洗脱并解交联：1）在所有样品管和2%Input管中均加入150ul1×ChIP洗脱缓冲液（75ul2×ChIP洗脱缓冲液+75ul水），其中2%Input管室温放置，随后使用。2）65°C孵育40分钟。3）将离心管放在磁性分离架上，静置，溶液澄清后，将上清（染色质）转移到新的离心管中。4）在所有管中，包括第一步的2%Input管，加入6ul5MNaCl和2ul蛋白酶K，65°C孵育2.5-3h。（6）用离心柱通过结合、漂洗和洗脱过程纯化DNA。
山西医科大学硕士学位论文13（7）用PCR定量进行ChIP富集效率的分析PCR扩增包括阳性对照、阴性对照、Input对照以及空白对照。每个PCR管中加入18μL反应体系和2μL各自对应的DNA样品作为模板，PCR反应体系配制（表1-1）和反应程序（表1-2）如下所示：表1-1PCR反应体系试剂体积无核酸酶的水12.5ul10×PCR缓冲液2.0ul4mMdNTP混合物1.0ul5μMRPL30引物2.0ulTaqDNA聚合酶0.5ul总共18ul表1-2PCR反应程序过程温度时间a预变性95℃5minb变性95℃30sc退火62℃30sd延伸72℃30se重复b-d，共34个循环f终末延伸72℃5min从每个反应管中取10ul进行2%琼脂糖凝胶电泳。Input对照、阳性对照于161bp处获得RPL30基因条带，如图1-3所示。以上结果说明ChIP实验是有效的。图1-3阳性对照、阴性对照及Input对照扩增产物用全波长多功能酶标仪检测三个重复hnRNPE2ChIP样品及Input对照的浓度及纯度，见表1-1。ChIP-Seq的送样要求为：浓度≥1ng/μL；纯度为1.8-2.2；总DNA量≥20ng，本次的指标均满足。
【参考文献】：
期刊论文
[1]人乳头瘤病毒16早期基因E2和E6与核不均一核糖核蛋白E2在宫颈癌变中的作用及其交互效应[J]. 高雯,丁玲,宋志超,冯美娟,刘春亮,李小雪,宋丽,吕元婧,王金桃. 中华预防医学杂志. 2020(01)
[2]PCBP2促进口蹄疫病毒增殖的机制研究[J]. 何艳春,杨文萍,付绍祖,郑海学,杨孝朴. 畜牧兽医学报. 2018(07)
[3]Cancer incidence and mortality in China, 2014[J]. Wanqing Chen,Kexin Sun,Rongshou Zheng,Hongmei Zeng,Siwei Zhang,Changfa Xia,Zhixun Yang,He Li,Xiaonong Zou,Jie He. Chinese Journal of Cancer Research. 2018(01)
[4]细胞外信号调节激酶1/2表达与HPV16感染及其交互效应在子宫颈癌变中的作用[J]. 樊石磊,丁玲,任志英,陈霄,孙雪松,李聪聪,刘春亮,贾吴琳,李巧玲,王金桃. 中华流行病学杂志. 2017 (01)
[5]多聚胞嘧啶结合蛋白结构与功能研究进展[J]. 徐荣发,周阳,刘海涛,施海峰. 生物学杂志. 2015(05)
[6]小RNA干扰PCBP2在神经胶质瘤细胞中对P53相关基因的调节和对细胞增殖的影响[J]. 韩为,阴彬,彭小忠. 基础医学与临床. 2014(06)
[7]宫颈癌相关基因的筛选及生物信息学分析[J]. 陈数珍,马文丽,郑文岭. 南方医科大学学报. 2008(04)
[8]内含子与基因表达调控[J]. 丁红梅,邵根宝,徐银学. 畜牧与兽医. 2006(03)
硕士论文
[1]hnRNP E2对HPV16关键基因的调节及其在宫颈病变中的作用[D]. 宋志超.山西医科大学 2018
[2]hnRNP E1与HPV16早期基因E2和E6在宫颈病变中的作用及交互效应[D]. 李巧玲.山西医科大学 2017
本文编号：2978352
【文章来源】： 高雯 山西医科大学
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
研究对象筛选流程图
山西医科大学硕士学位论文12图1-2染色质酶切情况5）测纯化后的DNA浓度，其在50-200μg/mL之间可进行下一步实验。（4）染色质免疫沉淀：1）1个IP反应需含有7-8μgDNA的交联染色质片段，根据DNA浓度，计算其体积，每个样品管中均取10μL出来作为2%输入对照（2%Input），-20°C保存至第（5）的1）中使用。2）向每个实验管中加1.5μgAnti-hnRNPE2抗体；阴性对照管加2μL正常兔IgG;阳性对照管加10μL组蛋白H3RabbitmAb，4℃孵育过夜。3）取30ul蛋白G磁珠加入到每个管中，4°C摇床孵育2小时。4）将离心管放在磁性分离架上，蛋白G磁珠吸附至管壁，溶液澄清后，吸走上清。5）加入1ml低盐漂洗液，取下样品管，4°C摇床孵育5分钟，重复4）和5）两次。（3mL低盐漂洗液：300μL10×ChIPBuffer+2.7mL超纯水）6）加入1ml高盐漂洗液，取下样品管，4°C摇床孵育5分钟，重新至于磁性分离架上，溶液澄清后，吸走上清。（1mL高盐漂洗液：100μL10×ChIPBuffer+900μL超纯水+70μL5MNaCl）（5）将染色体从抗体/蛋白G微珠上洗脱并解交联：1）在所有样品管和2%Input管中均加入150ul1×ChIP洗脱缓冲液（75ul2×ChIP洗脱缓冲液+75ul水），其中2%Input管室温放置，随后使用。2）65°C孵育40分钟。3）将离心管放在磁性分离架上，静置，溶液澄清后，将上清（染色质）转移到新的离心管中。4）在所有管中，包括第一步的2%Input管，加入6ul5MNaCl和2ul蛋白酶K，65°C孵育2.5-3h。（6）用离心柱通过结合、漂洗和洗脱过程纯化DNA。
山西医科大学硕士学位论文13（7）用PCR定量进行ChIP富集效率的分析PCR扩增包括阳性对照、阴性对照、Input对照以及空白对照。每个PCR管中加入18μL反应体系和2μL各自对应的DNA样品作为模板，PCR反应体系配制（表1-1）和反应程序（表1-2）如下所示：表1-1PCR反应体系试剂体积无核酸酶的水12.5ul10×PCR缓冲液2.0ul4mMdNTP混合物1.0ul5μMRPL30引物2.0ulTaqDNA聚合酶0.5ul总共18ul表1-2PCR反应程序过程温度时间a预变性95℃5minb变性95℃30sc退火62℃30sd延伸72℃30se重复b-d，共34个循环f终末延伸72℃5min从每个反应管中取10ul进行2%琼脂糖凝胶电泳。Input对照、阳性对照于161bp处获得RPL30基因条带，如图1-3所示。以上结果说明ChIP实验是有效的。图1-3阳性对照、阴性对照及Input对照扩增产物用全波长多功能酶标仪检测三个重复hnRNPE2ChIP样品及Input对照的浓度及纯度，见表1-1。ChIP-Seq的送样要求为：浓度≥1ng/μL；纯度为1.8-2.2；总DNA量≥20ng，本次的指标均满足。
【参考文献】：
期刊论文
[1]人乳头瘤病毒16早期基因E2和E6与核不均一核糖核蛋白E2在宫颈癌变中的作用及其交互效应[J]. 高雯,丁玲,宋志超,冯美娟,刘春亮,李小雪,宋丽,吕元婧,王金桃. 中华预防医学杂志. 2020(01)
[2]PCBP2促进口蹄疫病毒增殖的机制研究[J]. 何艳春,杨文萍,付绍祖,郑海学,杨孝朴. 畜牧兽医学报. 2018(07)
[3]Cancer incidence and mortality in China, 2014[J]. Wanqing Chen,Kexin Sun,Rongshou Zheng,Hongmei Zeng,Siwei Zhang,Changfa Xia,Zhixun Yang,He Li,Xiaonong Zou,Jie He. Chinese Journal of Cancer Research. 2018(01)
[4]细胞外信号调节激酶1/2表达与HPV16感染及其交互效应在子宫颈癌变中的作用[J]. 樊石磊,丁玲,任志英,陈霄,孙雪松,李聪聪,刘春亮,贾吴琳,李巧玲,王金桃. 中华流行病学杂志. 2017 (01)
[5]多聚胞嘧啶结合蛋白结构与功能研究进展[J]. 徐荣发,周阳,刘海涛,施海峰. 生物学杂志. 2015(05)
[6]小RNA干扰PCBP2在神经胶质瘤细胞中对P53相关基因的调节和对细胞增殖的影响[J]. 韩为,阴彬,彭小忠. 基础医学与临床. 2014(06)
[7]宫颈癌相关基因的筛选及生物信息学分析[J]. 陈数珍,马文丽,郑文岭. 南方医科大学学报. 2008(04)
[8]内含子与基因表达调控[J]. 丁红梅,邵根宝,徐银学. 畜牧与兽医. 2006(03)
硕士论文
[1]hnRNP E2对HPV16关键基因的调节及其在宫颈病变中的作用[D]. 宋志超.山西医科大学 2018
[2]hnRNP E1与HPV16早期基因E2和E6在宫颈病变中的作用及交互效应[D]. 李巧玲.山西医科大学 2017
本文编号：2978352
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