尿液游离DNA制备及其表观遗传修饰分析

发布时间：2021-01-23 00:13

　　5-甲基胞嘧啶（5mC）广泛存在于哺乳动物基因组DNA中。5mC在TET蛋白作用下可被氧化生成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）。其中,5mC和5hmC在哺乳动物胚胎发育、基因表达等方面发挥着重要的生物学功能。与此同时,这些DNA表观遗传修饰的异常改变与癌症的发生、发展密切相关,可作为潜在的生物标志物。由于尿液取材方便,并且具有真正意义上无创伤性的优点,尿液游离DNA在疾病诊断、预后等方面得到了较多的研究。但目前关于尿液中游离DNA表观遗传修饰方面的研究有限。尿液中游离DNA含量低,如何获得足够量、高纯度的游离DNA依然充满挑战。本论文建立尿液游离DNA提取的新方法,并发展了其表观修饰分析方法。首先,发展了基于石墨化碳材料提取尿液游离DNA的固相萃取（SPE）法。该方法操作简便,样品容量大,单个自制的SPE柱可应用于200 mL尿液的提取。从80 mL的尿液中能够提取得到21 ng的游离DNA。但目前条件下,该方法还不能够完全的将杂质与DNA分离开来,需要进一步探索。其次,以二氧化硅作为吸附材料,发展了提取尿液游离DNA的方法。该方法操... 

【文章来源】：江汉大学湖北省

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

尿液游离DNA两种来源:泌尿系统细胞及穿过肾脏屏障的游离DNA[33]

表观遗传学是指在没有DNA序列改变的情况下发生的遗传性表型改变。其中DNA甲基化是被广泛研究的表观遗传学改变之一。DNA甲基化修饰是表观遗传学中重要的调控基因表达方式之一,其存在于大多数生物体内,并且发挥着重要的生物学功能。DNA甲基化的发生是以S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,通过DNA甲基化转移酶(DMTA)的生物催化,将甲基基团转移到DNA碱基的特定结构上。DNA甲基化通常发生在胞嘧啶C5上形成5-甲基胞嘧啶(5mC),在生物体主动去甲基化的过程中(如图1-2所示),5mC会被去甲基化转移酶(TET家族蛋白)进一步氧化形成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)[1,2],5-醛基胞嘧啶(5fC),5-羧基胞嘧啶(5caC)[3]。除此之外,最近的一些研究在高等真核生物[67]以及人类基因组[68]中发现了普遍存在于原核生物中的甲基化修饰——N6-甲基腺嘌呤(6mA),其确切的生物学功能仍然处在初期探索阶段。在生物体内,这些修饰都是处于动态变化的过程,并发挥着已知(未知)的生物学功能。下面将对发生在胞嘧啶上的DNA修饰进行简要的介绍。1.4.1 5-甲基胞嘧啶

目前,已经发展了较多的方法检测DNA甲基化及其一系列的氧化产物。例如:免疫法、电化学法、微流控技术、液相色谱串联质谱法、DNA测序技术等[79]。这些方法都有各自的优、缺点。下面将对主要的一些检测方法进行简要的介绍。1.5.1 液相色谱串联质谱技术


本文编号：2994168