白念珠菌CaCNE1功能的研究
发布时间：2021-01-31 03:08
白念珠菌是人类最常见的条件性真菌病原体。在大多数免疫系统正常的人体中,白念珠菌是一种无害的共生体,但在免疫能力低下的人体中主要通过酵母-菌丝形态的转换导致白念珠菌迅速增殖并引起感染。临床上可用于治疗白念珠菌感染的抗真菌药物有限,长期重复使用这些抗真菌药物导致白念珠菌耐药现象越来越严重,迫切需要开发新型的抗真菌药物。本论文通过氨基酸序列相似性比对,在白念珠菌中发现了与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae,Sc）中编码钙联蛋白的ScCNE1同源的基因CaCNE1。ScCNE1在酿酒酵母细胞中编码的钙联蛋白是一种分子伴侣,帮助糖蛋白折叠、组装,并起到内质网质量控制的作用。但CaCNE1的功能目前还不清楚。本文采用同源重组的原理敲除白念珠菌CaCNE1,成功构建CaCNE1缺陷型菌株。通过抗真菌药物表型试验、细胞壁组分测定试验、菌丝发育试验和对小鼠的毒力试验等研究CaCNE1在白念珠菌在应答药物压力、细胞壁组分、菌丝发育、内质网功能和毒力等方面的影响。我们得出以下结论:1)白念珠菌CaCNE1缺失后对氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、刚果红、荧光增白剂、环孢菌素A、衣霉素、潮霉素...
【文章来源】：淮北师范大学安徽省
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
白念珠菌细胞壁的结构[42]
白念珠菌CaCNE1功能的研究7的手段[51-52]。图1-2Cas9基因敲除原理[51]Fig.1-2Cas9knockdownschematic[51].1.8本课题的研究内容与意义白念珠菌被广泛地认为是最具致病力的念珠菌种，人体正常菌群的平衡或免疫防御系统被破坏，会导致从浅表粘膜感染至高死亡率的全身系统性感染。这种条件病原菌是如何从共生菌株转变为病原菌，一直都是一个难题。药物种类少、耐药性严重等问题的存在使开发新型抗真菌药物变的越来越急迫。本论文通过氨基酸序列相似性比对，发现了白念珠菌中与酿酒酵母编码钙联蛋白ScCne1同源的CaCNE1，推测CaCNE1编码白念珠菌的钙联蛋白，钙联蛋白是一种分子伴侣，可能参与蛋白质的折叠、组装。但CaCNE1的功能目前还不清楚，所以我们选取了CaCNE1作为本论文的研究对象。本实验利用同源重组的原理敲除CaCNE1，构建CaCNE1缺陷型菌株，进行了抗真菌药物表型试验、细胞壁组分测定试验、菌丝发育试验和对小鼠的毒力试验等研究CaCNE1在白念珠菌对应答药物压力、细胞壁组分、菌丝发育、内质网功能和毒力等方面的影响，初步揭示CaCNE1的功能，为开发新型的抗真菌药物新思路。
白念珠菌CaCNE1功能的研究19表2-11表型筛选所用药物Table.2-11Drμgsofphenotypescreen注：Flu：氟康唑，SDS：十二烷基磺酸钠，CR：刚果红，VK3：维生素K3，ITZ：伊曲康唑，KCZ：酮康唑，CFW：荧光增白剂，CSA：环孢菌素A，Teb：特比萘芬，TM：衣霉素图2-1固体平板表型菌液浓度梯度Fig.2-1Concentrationgradientsofcultureinsolidplatephenotype2.2.9菌丝发育分析（1）液体菌丝实验：在超净工作台中挑取SN76+CIp10、Cacne1/Cacne1+CIp10和Cacne1/Cacne1+CIp10-CaCNE1单菌落，接种到SD-Ura液体培养基试管中，30℃摇床过夜培养。震荡摇匀，吸取600μL菌液加入到5.4mLYPD+10%FBS液体培养基中，37℃摇床培养。在1.5h和3h时分别取样，5000rpm，3min，吸尽上清，显微镜观察。（2）固体菌丝实验：在超净工作台中挑取SN76+CIp10、Cacne1/Cacne1+CIp10和Cacne1/Cacne1+CIp10-CaCNE1单菌落，接种到SD-Ura液体培养基试管中，30℃摇床过夜培养。倍比稀释菌液，吸取100μL10-7的菌液涂布到YPD+10%FBS固体平板上，37℃培养3-7d，观察菌落形态。药物浓度药物浓度CaCl20.4、0.6、0.8mol·L-1KCZ0.25、0.5μg·mL-1Flu1.25、2.5μg·mL-1CFW50、100μg·mL-1SDS0.02%、0.04%CSA6.25、12.5μg·mL-1CR50、100μg·mL-1Teb10、20μg·mL-1VK340、80、160μg·mL-1ITZ0.25、0.5μg·mL-1TM5、7.5、10μg·mL-1
【参考文献】：
期刊论文
[1]白念珠菌耐药机制研究进展[J]. 王航,阎澜. 中国真菌学杂志. 2018(05)
[2]白念珠菌细胞内钙离子稳态和钙离子/钙调磷酸酯酶信号途径的调控机理研究进展[J]. 徐大勇,蒋伶活. 中国细胞生物学学报. 2016(05)
博士论文
[1]中国多中心侵袭性感染光滑念珠菌复合体流行病学及棘白菌素耐药机制研究[D]. 侯欣.北京协和医学院 2019
[2]ADH1基因与白念珠菌耐药性和致病力的相关性研究[D]. 宋延君.暨南大学 2017
[3]钙稳态系统在白念珠菌形态发生及压力应答中的功能研究[D]. 喻其林.南开大学 2013
硕士论文
[1]白念珠菌orf19.1034功能的研究[D]. 王曼曼.淮北师范大学 2019
[2]外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及Candida Africana的分子鉴定[D]. 晏亮.中国人民解放军海军军医大学 2018
本文编号：3010108
【文章来源】：淮北师范大学安徽省
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
白念珠菌细胞壁的结构[42]
白念珠菌CaCNE1功能的研究7的手段[51-52]。图1-2Cas9基因敲除原理[51]Fig.1-2Cas9knockdownschematic[51].1.8本课题的研究内容与意义白念珠菌被广泛地认为是最具致病力的念珠菌种，人体正常菌群的平衡或免疫防御系统被破坏，会导致从浅表粘膜感染至高死亡率的全身系统性感染。这种条件病原菌是如何从共生菌株转变为病原菌，一直都是一个难题。药物种类少、耐药性严重等问题的存在使开发新型抗真菌药物变的越来越急迫。本论文通过氨基酸序列相似性比对，发现了白念珠菌中与酿酒酵母编码钙联蛋白ScCne1同源的CaCNE1，推测CaCNE1编码白念珠菌的钙联蛋白，钙联蛋白是一种分子伴侣，可能参与蛋白质的折叠、组装。但CaCNE1的功能目前还不清楚，所以我们选取了CaCNE1作为本论文的研究对象。本实验利用同源重组的原理敲除CaCNE1，构建CaCNE1缺陷型菌株，进行了抗真菌药物表型试验、细胞壁组分测定试验、菌丝发育试验和对小鼠的毒力试验等研究CaCNE1在白念珠菌对应答药物压力、细胞壁组分、菌丝发育、内质网功能和毒力等方面的影响，初步揭示CaCNE1的功能，为开发新型的抗真菌药物新思路。
白念珠菌CaCNE1功能的研究19表2-11表型筛选所用药物Table.2-11Drμgsofphenotypescreen注：Flu：氟康唑，SDS：十二烷基磺酸钠，CR：刚果红，VK3：维生素K3，ITZ：伊曲康唑，KCZ：酮康唑，CFW：荧光增白剂，CSA：环孢菌素A，Teb：特比萘芬，TM：衣霉素图2-1固体平板表型菌液浓度梯度Fig.2-1Concentrationgradientsofcultureinsolidplatephenotype2.2.9菌丝发育分析（1）液体菌丝实验：在超净工作台中挑取SN76+CIp10、Cacne1/Cacne1+CIp10和Cacne1/Cacne1+CIp10-CaCNE1单菌落，接种到SD-Ura液体培养基试管中，30℃摇床过夜培养。震荡摇匀，吸取600μL菌液加入到5.4mLYPD+10%FBS液体培养基中，37℃摇床培养。在1.5h和3h时分别取样，5000rpm，3min，吸尽上清，显微镜观察。（2）固体菌丝实验：在超净工作台中挑取SN76+CIp10、Cacne1/Cacne1+CIp10和Cacne1/Cacne1+CIp10-CaCNE1单菌落，接种到SD-Ura液体培养基试管中，30℃摇床过夜培养。倍比稀释菌液，吸取100μL10-7的菌液涂布到YPD+10%FBS固体平板上，37℃培养3-7d，观察菌落形态。药物浓度药物浓度CaCl20.4、0.6、0.8mol·L-1KCZ0.25、0.5μg·mL-1Flu1.25、2.5μg·mL-1CFW50、100μg·mL-1SDS0.02%、0.04%CSA6.25、12.5μg·mL-1CR50、100μg·mL-1Teb10、20μg·mL-1VK340、80、160μg·mL-1ITZ0.25、0.5μg·mL-1TM5、7.5、10μg·mL-1
【参考文献】：
期刊论文
[1]白念珠菌耐药机制研究进展[J]. 王航,阎澜. 中国真菌学杂志. 2018(05)
[2]白念珠菌细胞内钙离子稳态和钙离子/钙调磷酸酯酶信号途径的调控机理研究进展[J]. 徐大勇,蒋伶活. 中国细胞生物学学报. 2016(05)
博士论文
[1]中国多中心侵袭性感染光滑念珠菌复合体流行病学及棘白菌素耐药机制研究[D]. 侯欣.北京协和医学院 2019
[2]ADH1基因与白念珠菌耐药性和致病力的相关性研究[D]. 宋延君.暨南大学 2017
[3]钙稳态系统在白念珠菌形态发生及压力应答中的功能研究[D]. 喻其林.南开大学 2013
硕士论文
[1]白念珠菌orf19.1034功能的研究[D]. 王曼曼.淮北师范大学 2019
[2]外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及Candida Africana的分子鉴定[D]. 晏亮.中国人民解放军海军军医大学 2018
本文编号：3010108
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