miR-99a通过调控肿瘤相关巨噬细胞影响子宫内膜癌进展的机制研究
发布时间：2021-03-11 09:17
目的:探讨miR-99a在肿瘤相关巨噬细胞极化及其介导的对子宫内膜癌恶性生物学表型调控中的机制,为深入研究子宫内膜癌的发生发展、转归及其生物治疗奠定实验基础和理论依据。方法:首先用免疫组化法检测子宫内膜癌组织中CD68和CD31表达;免疫磁珠法分选肿瘤间质中的CD68阳性TAMs,并运用miRNAs基因微阵列技术比较不同浸润深度的子宫内膜癌组织中TAMs miRNAs表达差异;再用人子宫内膜癌细胞培养上清诱导人单核细胞向M2型巨噬细胞分化;再将人工合成的miR-99a模拟物片段转染至诱导后巨噬细胞,采用RT-PCR法检测miR-99a和M2型巨噬细胞相关因子CD206、CD163以及CD68表达变化,并运用酶联免疫吸附法检测巨噬细胞分泌相关细胞因子IL-12、IL-4和IL-10分泌变化;最后将过表达miR-99a的诱导后巨噬细胞与子宫内膜癌细胞共培养,用Transwell法检测过表达miR-99a对诱导后巨噬细胞向肿瘤细胞募集作用的影响,并用CCK-8、Transwell及体外血管拟态形成实验检测子宫内膜癌细胞增殖、侵袭及血管形成能力,WB检测可能作用的通路mTOR及其下游蛋白在过表...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
浸润深度>1/2肌层与浸润深度<1/2肌层的EC患者肿瘤组织中CD68+TAM细胞及CD31+阳性表达免疫组化示例图
2.1.2 miR-99a 参与 EC 组织 TAMs 的浸润调控我们运用免疫磁珠法分选出肿瘤间质中 CD68+TAMs，运用 miRNAs 基因微阵列技术比较了 8 对浸润深度>1/2 肌层与浸润深度<1/2 肌层的 EC 患者癌灶组织中TAMs miRNAs 表达谱的差异，结果发现，浸润深度>1/2 肌层患者组织 TAMs 中miR-99a 的表达较浸润深度<1/2 肌层患者组织 TAMs 中表达明显下降（图 2）；本课题组前期实验结果显示，与癌旁组织相比肿瘤组织中 miR-99a 的表达明显下降[8]，提示 miR-99a 的抑癌功能可作用于肿瘤细胞和肿瘤微环境中的 TAMs。
重庆医科大学硕士研究生学位论文25图3RT-PCR法检测诱导后CD206、CD163及CD68在U937细胞中的表达Fig.3TheexpressionsofCD206,CD163andCD68inU937andM2cellsweredetectedbyRT-PCR.2.2.2过表达miR-99a能够逆转单核细胞向TAMs极化将诱导后的单核细胞分别转染miR-99a及scramble模拟片段，转染后检测其中miR-99a表达差异，证实转染后miR-99a后诱导后细胞miR-99a表达较对照组增加（t=19.61，13.81，P值均＜0.01；图4A）。进一步运用RT-PCR法检测了转染miR-99a后单核细胞中CD68、CD163以及CD206表达变化，结果如图4B所示，CD68及CD163较对照组表达下降（t=8.179，11.78，P值均＜0.01；图4B），CD206表达两组间结果无明显差异（t=0.9951，P＞0.05；图4B）。运用ELISA法我们检测了转染miR-99a后诱导单核细胞分泌相关细胞因子的差异，结果表明，过表达miR-99a后诱导单核细胞IL-12分泌增多，而IL-4、IL-10分泌减少（t=6.236，4.896，5.857，P值均＜0.01；图4C），提示巨噬细胞向M1型极化，抑制了M2型极化（图4C），以上结果表明，EC细胞共培养后诱导单核细胞向M2型巨噬细胞极化，转染miR-99a后能够抑制单核细胞向M2型极化。
【参考文献】：
期刊论文
[1]肿瘤相关巨噬细胞研究进展[J]. 杨黎,张毅. 中国免疫学杂志. 2020(02)
本文编号：3076239
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
浸润深度>1/2肌层与浸润深度<1/2肌层的EC患者肿瘤组织中CD68+TAM细胞及CD31+阳性表达免疫组化示例图
2.1.2 miR-99a 参与 EC 组织 TAMs 的浸润调控我们运用免疫磁珠法分选出肿瘤间质中 CD68+TAMs，运用 miRNAs 基因微阵列技术比较了 8 对浸润深度>1/2 肌层与浸润深度<1/2 肌层的 EC 患者癌灶组织中TAMs miRNAs 表达谱的差异，结果发现，浸润深度>1/2 肌层患者组织 TAMs 中miR-99a 的表达较浸润深度<1/2 肌层患者组织 TAMs 中表达明显下降（图 2）；本课题组前期实验结果显示，与癌旁组织相比肿瘤组织中 miR-99a 的表达明显下降[8]，提示 miR-99a 的抑癌功能可作用于肿瘤细胞和肿瘤微环境中的 TAMs。
重庆医科大学硕士研究生学位论文25图3RT-PCR法检测诱导后CD206、CD163及CD68在U937细胞中的表达Fig.3TheexpressionsofCD206,CD163andCD68inU937andM2cellsweredetectedbyRT-PCR.2.2.2过表达miR-99a能够逆转单核细胞向TAMs极化将诱导后的单核细胞分别转染miR-99a及scramble模拟片段，转染后检测其中miR-99a表达差异，证实转染后miR-99a后诱导后细胞miR-99a表达较对照组增加（t=19.61，13.81，P值均＜0.01；图4A）。进一步运用RT-PCR法检测了转染miR-99a后单核细胞中CD68、CD163以及CD206表达变化，结果如图4B所示，CD68及CD163较对照组表达下降（t=8.179，11.78，P值均＜0.01；图4B），CD206表达两组间结果无明显差异（t=0.9951，P＞0.05；图4B）。运用ELISA法我们检测了转染miR-99a后诱导单核细胞分泌相关细胞因子的差异，结果表明，过表达miR-99a后诱导单核细胞IL-12分泌增多，而IL-4、IL-10分泌减少（t=6.236，4.896，5.857，P值均＜0.01；图4C），提示巨噬细胞向M1型极化，抑制了M2型极化（图4C），以上结果表明，EC细胞共培养后诱导单核细胞向M2型巨噬细胞极化，转染miR-99a后能够抑制单核细胞向M2型极化。
【参考文献】：
期刊论文
[1]肿瘤相关巨噬细胞研究进展[J]. 杨黎,张毅. 中国免疫学杂志. 2020(02)
本文编号：3076239
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