利用哺乳动物细胞表达TRPM8离子通道及其结构分析

发布时间：2021-06-10 17:17

　　冷受体TRPM8是瞬时受体电位（TRP）阳离子通道家族的成员,参与了多种人体的生理病理过程,包括疼痛转导、离子稳态、温度调节以及肿瘤的发生等多种细胞功能,因此,TRPM8是重要的疼痛和癌症的靶点。但是,目前人源TRPM8的结构还未被解析,大大阻碍了人们对于TRPM8分子机制的认识和靶点药物的研发。为了解析高分辨率人源TRPM8结构,本研究利用哺乳动物表达系统筛选了不同的克隆提高蛋白产量,以及筛选不同去污剂以提高蛋白稳定性,最终得到高产量和高纯度的人源TRPM8蛋白。同时,我们成功组装TRPM8蛋白于纳米圆盘之中,其抗原可用于免疫获得治疗TRPM8相关疾病如慢性疼痛、冷疼痛和偏头痛等的抗体。此外,良好的生化和结构数据表明,利用单分子冷冻电镜技术我们将在短期获得人源全长的TRPM8结构。 

【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校

【文章页数】：46 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

TRPM8（灰色）与薄荷醇类似物WS-12（绿色）的复合物结构图[40]

第二章TRPM8蛋白的克隆载体构建孵育1h，取200uL的菌液涂布于含有氨苄青霉素的琼脂平板上，放置在37℃的孵箱中培养过夜。（4）第二天取出琼脂平板，观察菌落的状态排除是否有杂菌污染。从中挑选6-8个大小均匀靠近中心的菌落，用小枪头小心挑起后打入5mL加了氨苄青霉素的LB培养基中，放置在37℃的恒温摇床上培养至少10h，直至菌液明显混浊，放入4℃冰箱中保存。（5）取菌液进行上述PCR步骤，跑胶后放置在紫外灯下进行观察。若能得到明显条带的则为阳性菌，分装菌液送去测序，与模板DNA序列进行比对，若无突变，进行菌液小提后保存质粒，若有突变则重复上述步骤直至获得没有基因突变的重组克拢2.4讨论分子克隆是把目的基因插入克隆载体之中，在体外形成重组克隆载体，从而获得大量目的基因的一种方法，它的出现为多种学科如医学、工业生产、基因治疗等的发展产生了深远影响。根据实验，我们成功获得了三个TRPM8的重组克隆，测序均无突变：全长TRPM8FL（1-1103AA）、截掉C端的TRPM8CTD（1-993AA）和截去了N、C端即跨膜区的TRPM8TMD（640-993AA）。它们的N端都连接了一个麦芽糖结合蛋白MBP以方便蛋白纯化，以及一个HRV3C位点，这种水解限制位点有利于后续实验中从蛋白质上切除MBP标记。这三种克隆载体将应用于后续的实验之中。图2.1TRPM8三种克隆的示意图。这三种克隆的载体pEGBacMam上均带有MBP标签（蓝色）和HRV3C位点（紫色）。A.TRPM8全长（TRPM8FL）B.截掉C端的TRPM8（TRPM8CTD）C.截掉N端和C端即跨膜区TRPM8（TRPM8TMD）、9

第三章TRPM8蛋白的克隆和纯化条件筛选图3.1三种克隆的TRPM8蛋白的SEC结果以及SDS-PAGE结果。A.TRPM8FLB.TRPM8CTDC.TRPM8TMDD.在SDS-PAGE中分析了这三个克隆的纯化蛋白，并用考马斯亮蓝法进行染色。条带1：TRPM8FL；条带2：TRPM8CTD；条带3：TRPM8TMD。3.4.2表达条件的筛选由于TRPM8TMD蛋白具有最高的产量，因此在大规模表达纯化蛋白之前，我们选用该克隆来筛选蛋白质表达的最佳条件。3.4.2.1表达温度对蛋白产量的影响在之前的哺乳动物表达系统研究中已经表明，降低病毒转导后的培养温度可以提高蛋白质的产量。这是由于在低温培养时，蛋白质转录和翻译的速率相对较慢，这使得膜蛋白能够被正确地折叠并整合到脂质膜中[31]。为了验证表达温度对蛋白质产量的影响，我们分别在加入三代病毒后将两份细胞转移至30℃和37℃的摇床中分别培养，72小时候收集对应细胞并进行纯化，方法步骤同上。图3.2（A）表明,在30℃条件下培养的细胞TRPM8TMD蛋白产量是在37℃条件下培养的10倍，且单分散性更好，这证明降低温度是提高蛋白产量必不可少的条件。16

【参考文献】：
期刊论文
[1]卫95块沉积相研究[J]. 岳立强,张霞,李延涛,汪重庆.  科技视界. 2018(16)



本文编号：3222798