NKG2D嵌合抗原受体修饰的NK细胞治疗结直肠癌患者的临床研究
发布时间：2021-07-09 11:12
目的:结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均位居前三位。约50%的患者存在远处转移,Ⅳ期结直肠癌患者的五年生存率不足10%。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）T细胞在治疗血液癌中已取得显著疗效,但仍难以攻克实体瘤,且存在严重细胞因子风暴、神经毒性等风险。自然杀伤（natural killer,NK）细胞在安全性、可及性上更优于T细胞,因此我们拟通过使用NK细胞作为NKG2D CAR的修饰载体,评估NKG2D CAR-NK细胞用于治疗结直肠癌晚期患者的安全性和可行性。方法:通过使用电穿孔的方法对NK细胞进行NKG2D mRNA CAR的修饰,利用流式细胞分析检测、IFN-γ酶联免疫斑点试验和细胞毒性杀伤试验检测NKG2D CAR-NK细胞的体外杀瘤能力。使用HCT116-luc结直肠癌细胞系构建NSG小鼠模型,通过活体动物成像技术和Kaplan-Meier生存分析来检测NKG2D CAR-NK细胞的体内抑瘤效果。进一步通过开展一项单臂、开放、剂量递增的单中心的初期临床研究（NCT03415100）来评估NKG2D CAR-NK细胞治...
【文章来源】：广州医科大学广东省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
剂量爬坡设计图
广州医科大学硕士学位论文30图2-1.（A）mRNACAR结构示意图；（B）流式细胞术检测NK细胞表面的NKG2DCAR表达水平和MFI值；（C）NKG2DpCAR表达的time-lapse分析结果图2.NKG2DpCAR-NK细胞具有更强的IFN-γ分泌能力和细胞毒性将来自同一供体并在相同培养条件下扩增的NK细胞分别使用等量的NKG2Dz和NKG2DpmRNACAR进行电穿孔修饰，然后比较NKG2Dz和NKG2DpCAR-NK的体外肿瘤杀伤活性。首先通过ELISPOT实验来检测IFN-γ的分泌水平来评价CAR-NK的IFN-γ分泌能力。使用人SKOV3卵巢癌细胞系、HCT116结直肠癌细胞系和Detroit562咽癌细胞系为靶细胞。将NK、CtrlCAR-NK、NKG2DpCAR-NK和NKG2DzCAR-NK分别与靶肿瘤细胞以5：1的E:T比例共培养过夜。NK细胞组和CtrlmRNACAR-NK细胞组作为阴性对照，发现NKG2DmRNACAR-NK细胞组与对照组相比，产生了更多更强的IFN-γ细胞因子。NKG2DmRNACAR-NK细胞产生的ELISPOT点显著高于其余两个对照组（图2-2A），差异具有统计学意义（P＜0.001）。而且NKG2DCAR-NK分别和SKOV3和Detroit562靶细胞共培养时，结果显示NKG2DpCAR-NK比NKG2DzCAR-NK具有更强的IFN-γ分泌能力。此外，我们还进行了转染NK细胞的细胞毒性杀伤实验检测，效应细胞与靶标细胞的比例范围由5：1到0.625：1，研究结果显示当SKOV3和Detroit细胞作为靶标时，NKG2DmRNACAR-NK细胞杀伤效果在5：1靶标比时达到60%，对比与其余两个对照组约20%的杀伤效果，NKG2DmRNACAR-NK细胞明显具有更强的杀伤效果（图2-2B）。当HCT116细胞作为靶标时，对照组在2.5：1靶标比时已达到30%的杀伤效果，而NKG2DmRNACAR-NK细胞在2.5：1靶标比时已经达到60-70%，进一步说明了NKG2DmRNACAR-NK细胞具有强大的杀瘤活性（图2-2B）。而且，在图2-2B中可见，NKG2Dp
广州医科大学硕士学位论文32图2-3.（A）HCT116-luc移植荷瘤小鼠肿瘤负荷监测变化图；（B）HCT116-luc荷瘤小鼠生存期曲线二、NKG2DCAR-NK细胞过继治疗结直肠癌患者的临床研究结果1.CAR-NK细胞过继治疗剂量爬坡设计团队开展了一项单臂、开放、剂量递增的临床研究（NCT03415100），用于评估过继输注NKG2DmRNACAR电穿孔修饰的NK细胞用于治疗转移性结直肠癌患者的安全性和可行性，本研究共入组了3例转移性结直肠癌患者。临床试验剂量爬坡设计如图3-1所示。第1位患者（1001）共回输2次，剂量分别为2×107和1×108个NKG2DCAR-NK细胞，每周1次；第2位患者（1002）共回输4次，剂量分别为1×108，3×108，5×108和7×108个NKG2DCAR-NK细胞，每周1次；第3位患者（1003）共回输6次，剂量分别为5×108，5×108，1×109，1×109，2×109和2×109个NKG2DCAR-NK细胞，每周2次。
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国城市癌症早诊早治项目进展[J]. 陈万青,李霓,石菊芳,任建松,陈宏达,李江,代敏,赫捷. 中国肿瘤. 2019(01)
[2]结直肠癌腹膜转移治疗的争议与思考[J]. 王磊,蔡建,秦启元. 中华外科杂志. 2018 (08)
[3]重视结直肠癌腹膜转移的合理诊断与治疗[J]. 武爱文,何国礼. 中华消化外科杂志. 2018 (02)
[4]结直肠癌腹膜转移诊治中国专家意见（2017）[J]. 赵志勋,裴炜,熊斌,崔书中,刘骞,王锡山. 中华结直肠疾病电子杂志. 2017(05)
[5]CAR-NK抗肿瘤研究的现状与发展趋势[J]. 殷书磊,于益芝,曹雪涛. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2016(01)
本文编号：3273636
【文章来源】：广州医科大学广东省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
剂量爬坡设计图
广州医科大学硕士学位论文30图2-1.（A）mRNACAR结构示意图；（B）流式细胞术检测NK细胞表面的NKG2DCAR表达水平和MFI值；（C）NKG2DpCAR表达的time-lapse分析结果图2.NKG2DpCAR-NK细胞具有更强的IFN-γ分泌能力和细胞毒性将来自同一供体并在相同培养条件下扩增的NK细胞分别使用等量的NKG2Dz和NKG2DpmRNACAR进行电穿孔修饰，然后比较NKG2Dz和NKG2DpCAR-NK的体外肿瘤杀伤活性。首先通过ELISPOT实验来检测IFN-γ的分泌水平来评价CAR-NK的IFN-γ分泌能力。使用人SKOV3卵巢癌细胞系、HCT116结直肠癌细胞系和Detroit562咽癌细胞系为靶细胞。将NK、CtrlCAR-NK、NKG2DpCAR-NK和NKG2DzCAR-NK分别与靶肿瘤细胞以5：1的E:T比例共培养过夜。NK细胞组和CtrlmRNACAR-NK细胞组作为阴性对照，发现NKG2DmRNACAR-NK细胞组与对照组相比，产生了更多更强的IFN-γ细胞因子。NKG2DmRNACAR-NK细胞产生的ELISPOT点显著高于其余两个对照组（图2-2A），差异具有统计学意义（P＜0.001）。而且NKG2DCAR-NK分别和SKOV3和Detroit562靶细胞共培养时，结果显示NKG2DpCAR-NK比NKG2DzCAR-NK具有更强的IFN-γ分泌能力。此外，我们还进行了转染NK细胞的细胞毒性杀伤实验检测，效应细胞与靶标细胞的比例范围由5：1到0.625：1，研究结果显示当SKOV3和Detroit细胞作为靶标时，NKG2DmRNACAR-NK细胞杀伤效果在5：1靶标比时达到60%，对比与其余两个对照组约20%的杀伤效果，NKG2DmRNACAR-NK细胞明显具有更强的杀伤效果（图2-2B）。当HCT116细胞作为靶标时，对照组在2.5：1靶标比时已达到30%的杀伤效果，而NKG2DmRNACAR-NK细胞在2.5：1靶标比时已经达到60-70%，进一步说明了NKG2DmRNACAR-NK细胞具有强大的杀瘤活性（图2-2B）。而且，在图2-2B中可见，NKG2Dp
广州医科大学硕士学位论文32图2-3.（A）HCT116-luc移植荷瘤小鼠肿瘤负荷监测变化图；（B）HCT116-luc荷瘤小鼠生存期曲线二、NKG2DCAR-NK细胞过继治疗结直肠癌患者的临床研究结果1.CAR-NK细胞过继治疗剂量爬坡设计团队开展了一项单臂、开放、剂量递增的临床研究（NCT03415100），用于评估过继输注NKG2DmRNACAR电穿孔修饰的NK细胞用于治疗转移性结直肠癌患者的安全性和可行性，本研究共入组了3例转移性结直肠癌患者。临床试验剂量爬坡设计如图3-1所示。第1位患者（1001）共回输2次，剂量分别为2×107和1×108个NKG2DCAR-NK细胞，每周1次；第2位患者（1002）共回输4次，剂量分别为1×108，3×108，5×108和7×108个NKG2DCAR-NK细胞，每周1次；第3位患者（1003）共回输6次，剂量分别为5×108，5×108，1×109，1×109，2×109和2×109个NKG2DCAR-NK细胞，每周2次。
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国城市癌症早诊早治项目进展[J]. 陈万青,李霓,石菊芳,任建松,陈宏达,李江,代敏,赫捷. 中国肿瘤. 2019(01)
[2]结直肠癌腹膜转移治疗的争议与思考[J]. 王磊,蔡建,秦启元. 中华外科杂志. 2018 (08)
[3]重视结直肠癌腹膜转移的合理诊断与治疗[J]. 武爱文,何国礼. 中华消化外科杂志. 2018 (02)
[4]结直肠癌腹膜转移诊治中国专家意见（2017）[J]. 赵志勋,裴炜,熊斌,崔书中,刘骞,王锡山. 中华结直肠疾病电子杂志. 2017(05)
[5]CAR-NK抗肿瘤研究的现状与发展趋势[J]. 殷书磊,于益芝,曹雪涛. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2016(01)
本文编号：3273636
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