环状RNA circSP3通过作为miR-198的海绵调节CDK4的表达促进肝细胞癌的增殖、迁移和侵袭

发布时间：2021-08-22 04:22

　　目的:探究在肝细胞肝癌中circSP3的表达、作用以及circSP3通过作为miR-198海绵调节CDK4的表达从而促进肝细胞癌的增殖、迁移和侵袭的相关机制。方法:采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验检测circSP3在肝细胞癌患者癌组织和癌旁肝组织中的表达水平,此外检测4种肝癌细胞（Hep-3B、Huh7、Bel-7402、SMMC-7721）和正常肝细胞（HL-77O2）中的表达水平。使用质粒转染以及慢病毒感染Hep-3B和Huh-7细胞,从而筛选得到过表达以及敲低circSP3表达的肝癌细胞株。同时采用CCK-8实验,Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验分别检测circSP3对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。采用裸鼠成瘤实验来验证circSP3在体内对细胞增殖活性的影响。然后使用生物信息学分析,qRT-PCR,双荧光素酶测定和蛋白质印迹分析circSP3,miR-198和CDK4之间的关系。之后的救援实验验证circSP3通过作为miR-198海绵调节CDK4的表达从而促进肝细胞癌的增殖、迁移和侵袭。结果:qRT-PCR结果表明,相比与癌旁肝组织和正常肝... 

【文章来源】：重庆医科大学重庆市

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

circSP3在HCC组织中的表达水平Figure1.RelativeexpressionofcircSP3inHCCtissues.qRT-PCR检测50对HCC组织和对应癌旁肝组织中circSP3的表达水平

重庆医科大学硕士研究生学位论文282.2circSP3环状结构确定通过Sanger测序，数据库查询和RNaseR处理确认circSP3的环状结构。CircSP3（chr2：174,819,600–174,820,960）源自SP3基因座中的外显子区域，该区域位于染色体2q31.1（图2A）上。为了确认circSP3的环状结构，我们首先将circSP3的PCR产物插入T载体进行Sanger测序。如图2B所示，测序结果与circBase提供的circSP3的反向剪接区域一致。另外，我们设计了两组引物，一组用于环形转录本的引物，另一组用于线性转录本的引物。然后，我们将circRNA敲低质粒转染到细胞中，并使用RTPCR检测SP3的环状和线性转录表达水平。结果表明，circSP3水平显著降低，而SP3线性转录本的表达水平没有变化（图2C）。最后，对RNA进行RNaseR核酸外切酶的消化抗性实验。结果表明，使用RNaseR核酸外切酶处理之后线性SP3表达水平被明显降低，而circSP3的表达水平没有明显变化（图2D）。总体而言，实验结果证明了circSP3的环状结构。图2.circSP3环状结构确定Figure2.ConfirmationofcircularstructureofcircSP3A,B.Sange测序以及数据库查询验证circSP3的位置以及环化位点。

重庆医科大学硕士研究生学位论文29C,D.qRT-PCR检测circSP3敲低以及RnaseR处理后线性SP3和circSP3的表达。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。A,B.SangesequencinganddatabasequeryverifythepositionofcircSP3andthecircularizationsite.C,D.qRT-PCRwasusedtodetectcircSP3knockdownandlinearSP3andcircSP3expressionafterRnaseRtreatment.*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.2.3circSP3在HCC细胞中的表达采用qRT-PCR对4种HCC细胞(Hep-3B,Huh7,Bel-7402和SMMC-7721)和正常肝细胞(HL-77O2)中circSP3的表达水平进行检测。结果表明，同正常肝细胞相比，4种HCC细胞中circSP3的表达水平均显著上调；相对于正常肝细胞，Hep-3B（P<0.05）,SMMC-7721（P<0.001）,Bel-7402（P<0.001）和Huh7（P<0.001）,中circSP3的表达量分别为：1.440±0.1286,1.603±0.05783,1.637±0.03180,2.222±0.1931。4种HCC细胞中，Huh-7细胞中circSP3的表达水平最高，而Hep-3B细胞中circSP3的表达水平最低。因此选用Hep-3B细胞和Huh-7细胞作为后续实验对象。图3.circSP3在HCC细胞中的表达水平Figure3.ExpressionofcircSP3inHCCcelllines.qRT-PCR检测4种HCC细胞(Hep-3B,Huh7,Bel-7402和SMMC-7721)和正常肝细胞(HL-77O2)中circSP3的表达水平。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。RelativecircSP3expressionlevelsinfiveHCCcelllines(Hep-3B,Huh7,SMMC-7721andBel-7402)andonenormalhumanhepatocyte(HL-7702)wasdetectedbyqRT-PCR.*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.


本文编号：3356993