土田七抗肿瘤作用及其机制研究
发布时间：2021-10-15 21:05
目的:癌症是全球疾病导致死亡的主要原因,严重危害着人类的生命健康。虽然随着社会经济与科技的不断发展,各种检测和治疗手段层出不穷,但癌症的死亡率却没有显著的下降,主要原因是肿瘤极易复发,以及相关治疗药物的副作用较大。因此寻找新的毒性小甚或无毒副作用的肿瘤治疗药物十分重要。姜科植物土田七是一味民族药,在广西少数民族地区使用,常用于治疗跌打损伤,风湿骨痛,月经过多、外伤出血及蛇虫咬伤等;已有研究表明,该药具有良好的抗肿瘤效果,其所含化学成分能够杀伤肝癌细胞。本课题拟采用中药化学分离、纯化与药理实验相结合的方法,筛选出土田七抗肿瘤的活性物质,并阐明其作用机制。方法:1土田七的总提取物及其分离纯化1.1研究土田七的提取方法,探讨不同因素对土田七提取率的影响。1.2对土田七总提取物利用大孔吸附树脂进行分离纯化,得到不同的洗脱部位。利用细胞杀伤实验和荷瘤小鼠对各洗脱部位进行抗肿瘤活性评估。选取活性最优的洗脱部位,再利用硅胶柱层析法进行分离纯化,并进行体外抗肝癌活性筛选。2土田七活性部位抗肿瘤药理作用机制的研究2.1利用不同给药浓度处理肝癌细胞,通过Western-blot检测诱导肝癌细胞凋亡的相关蛋...
【文章来源】：湖北中医药大学湖北省
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
姜科植物抗肿瘤筛选
土田七抗肿瘤作用及其机制研究11的增殖抑制率。4.4.2不同浓度乙醇洗脱部位抑制肝癌细胞增殖的结果用各洗脱部位对肝癌H22细胞进行处理，测定其细胞增殖抑制率。由图2可知，水洗脱部位对肝癌细胞并无明显的增殖抑制作用，30%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位对肝癌细胞具有一定的增殖抑制作用，70%乙醇洗脱部位对肝癌细胞的增殖抑制作用最为明显。另外，当浓度超过40μg/mL，70%乙醇洗脱部位对肝癌细胞的增殖有抑制作用，且药物浓度越高，抑制作用越明显。各洗脱部位相比较，IC50显示70%乙醇洗脱部位相对于其它组对肝癌细胞增殖抑制的浓度-抑制率曲线具有显著性差异(P＜0.05)。图2大孔树脂不同洗脱部位抑制肝癌细胞增殖的作用4.4.3不同浓度的乙醇洗脱部位诱导肝癌细胞凋亡的检测将对数生长期的肝癌H22细胞进行离心，弃掉上清液，调整细胞密度至1×106/mL。6孔板中每孔加入2mL细胞悬液，放入37oC培养箱中恒温培养24h。分别向各孔中加入不同浓度(浓度分别为：20、40、60、80、100μg/mL)的30%乙醇洗脱部位、70%乙醇洗脱部位及95%乙醇洗脱部位，对照组加入等体积的生理盐水(含DMSO)，在培养箱中处理24h。分别吸取各组上清液于离心管中，将胰蛋白酶消化细胞转移至各离心管中，进行离心(800rpm/min、5min)，吸取上清液，用预冷的磷酸缓冲液(PBS)对细胞进行洗涤，洗涤2次。按照试剂盒操作步骤，加入AnnexinV-FITC和PI染液，充分混匀后，避光染色半小时。检测细胞的凋亡情况。4.4.4不同浓度乙醇洗脱部位诱导肝癌细胞凋亡的结果用各洗脱部位对肝癌H22细胞进行处理，测定其细胞凋亡率。由图3
湖北中医药大学2020届硕士学位论文12可知，70%乙醇洗脱部位诱导肝癌细胞凋亡的作用最强，30%乙醇洗脱部位及95%乙醇洗脱部位作用次之。且随着各乙醇洗脱部位浓度的增加，细胞的凋亡率也随之增高。此外，当浓度为20、40、60μg/mL，70%乙醇洗脱部位与其他洗脱部位相比较，诱导细胞凋亡作用表现出显著性差异(P＜0.05)。当浓度为80、100μg/mL，70%乙醇洗脱部位与其他洗脱部位相比，它诱导细胞凋亡作用具有非常显著的差异(P＜0.01)。图3大孔树脂柱各洗脱部位对肝癌H22细胞凋亡的作用4.4.5讨论本课题采用CCK-8法对细胞增殖进行测定，而没有选择传统的MTT法，这是因为CCK-8法具有灵敏度高、重复性强、操作方便、检测速度快、结果准确等一系列优点。CCK-8的原理是其中含有的WST-8被氧化还原，从而生成黄色的甲臜染料，其生成的甲臜染料数量与活细胞数量成正比。根据体外药理实验的结果可知，可以确认70%洗脱部位效果最佳。4.5不同浓度的乙醇洗脱部位体内抑制肝癌细胞实验4.5.1细胞株来源肝癌细胞株H22(鼠源性；腹水型肝癌细胞株),购自于武汉大学中国典型培养物保藏中心。4.5.2实验动物来源昆明小鼠(雌性，4-6周；体重20-22g)，购自于湖北省实验动物研究中心。4.5.3实验方法25只4-6周龄的小鼠右腿外侧接种H22细胞，2×105/只。7天后，将25只小鼠随机分成5组，为生理盐水组、水洗脱部位组、30%乙醇洗脱
【参考文献】：
期刊论文
[1]新型内质网应激诱导蛋白TRIM25在乳腺癌细胞中的作用研究[J]. 陶诗诗,陈亮. 集成技术. 2020(01)
[2]姜黄、莪术、郁金三药临床应用情况分析[J]. 杨月红,潘宇炯,周昕,李瑶,杨铭. 药学服务与研究. 2019(06)
[3]内质网应激在肝脏糖脂代谢及代谢性肝病中的作用[J]. 程涵博,吕颂雅,刘勇. 中国细胞生物学学报. 2019(11)
[4]鹿茸多肽对轻度认知功能障碍模型大鼠海马组织中AKT、PI3K、Caspase-9表达的影响[J]. 赵昕彤,徐岩,周佳,李鑫,杨明慧,刘玥欣,律广富,林贺,许佳明,黄晓巍. 中国医院药学杂志. 2019(22)
[5]PI3K/AKT信号通路调控心肌细胞凋亡的研究进展[J]. 李玉华,赵敏. 疑难病杂志. 2019(11)
[6]Protective effects of organic extracts of Alpinia oxyphylla against hydrogen peroxide-induced cvtotoxicitv in PC12 cells[J]. Li-Hong Duan,Meng Li,Chun-Bao Wang,Qing-Mei Wang,Quan-Quan Liu,Wan-Feng Shang,Ya-Jin Shen,Zhuo-Hua Lin,Tong-Yang Sun,Zheng-Zhi Wu,Ying-Hong Li,Yu-Long Wang,Xun Luo. Neural Regeneration Research. 2020(04)
[7]内质网应激的信号通路及其与细胞凋亡相关疾病关系的研究进展[J]. 叶勇,赵海霞,张长城. 山东医药. 2019(17)
[8]甾醇载体蛋白2抑制剂的研究进展[J]. 陶涛,杜馨. 植物保护. 2019(02)
[9]姜黄化学成分及药理作用研究进展[J]. 孙林林,乔利,田振华,赵盼,蒋海强,杨雯晴,李运伦. 山东中医药大学学报. 2019(02)
[10]基于抗Aβ1-42淀粉样蛋白活性的不同产地姜黄质量评价研究[J]. 曾瑾,李青苗,王晓宇,戴瑛,周丽娟,赵军宁. 中药药理与临床. 2019(01)
博士论文
[1]黄丽娟教授学术思想临床经验总结及治疗高脂血症的临床研究[D]. 尚菊菊.北京中医药大学 2016
[2]猪圆环病毒2型感染诱导PK-15细胞内质网应激与凋亡的机制研究[D]. 周莹珊.浙江大学 2016
[3]自噬在LPS诱导的肺泡上皮细胞死亡中的作用及机制研究[D]. 李少莹.第三军医大学 2015
[4]肺癌细胞株中miRNA的筛选及miR-544a促进肺癌细胞转移的机制研究[D]. 莫晓媚.中国海洋大学 2014
[5]绒山羊肌内脂肪沉积特征及脂肪细胞分化机理的研究[D]. 杜琛.内蒙古农业大学 2014
[6]莪术溃坚方对胰腺癌抑瘤作用及其机理研究[D]. 徐新生.天津医科大学 2014
[7]ATF4和miR-4458对肝癌细胞的抑制作用及初步分子机制研究[D]. 唐丹.第二军医大学 2014
[8]铜负荷大鼠肝星状细胞凋亡p38MAPK信号通路探讨及通腑利湿化瘀散结方对其干预的代谢组学研究[D]. 张娟.湖北中医药大学 2012
[9]益智的抗氧化作用及成分研究[D]. 刘红.华南理工大学 2006
硕士论文
[1]半夏当归赤小豆汤抗肿瘤作用及机制研究[D]. 张群.河南大学 2019
[2]广西莪术中抗鼻咽癌活性成分开发及应用[D]. 李旭梅.桂林医学院 2018
[3]保妇康栓联合抗HPV生物蛋白敷料治疗高危型HPV感染的临床疗效[D]. 廖晨晨.湖北中医药大学 2017
[4]SSAT通过AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭[D]. 阮平.河南大学 2016
[5]三七总皂苷的大孔树脂吸附特性[D]. 侯懿娜.云南中医学院 2016
[6]山柰化学成分的研究[D]. 吴华东.华中科技大学 2016
[7]姜黄次生代谢产物生理调控研究[D]. 杨晨.华侨大学 2014
[8]中药郁金 姜黄 莪术的化学成分比较研究[D]. 王颖.重庆大学 2014
[9]益智化学成分的研究[D]. 侯蕾.北京协和医学院 2013
[10]Caspase家族在恶性黑色素瘤血管生成拟态形成过程中作用的初步研究[D]. 赵建民.天津医科大学 2012
本文编号：3438622
【文章来源】：湖北中医药大学湖北省
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
姜科植物抗肿瘤筛选
土田七抗肿瘤作用及其机制研究11的增殖抑制率。4.4.2不同浓度乙醇洗脱部位抑制肝癌细胞增殖的结果用各洗脱部位对肝癌H22细胞进行处理，测定其细胞增殖抑制率。由图2可知，水洗脱部位对肝癌细胞并无明显的增殖抑制作用，30%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位对肝癌细胞具有一定的增殖抑制作用，70%乙醇洗脱部位对肝癌细胞的增殖抑制作用最为明显。另外，当浓度超过40μg/mL，70%乙醇洗脱部位对肝癌细胞的增殖有抑制作用，且药物浓度越高，抑制作用越明显。各洗脱部位相比较，IC50显示70%乙醇洗脱部位相对于其它组对肝癌细胞增殖抑制的浓度-抑制率曲线具有显著性差异(P＜0.05)。图2大孔树脂不同洗脱部位抑制肝癌细胞增殖的作用4.4.3不同浓度的乙醇洗脱部位诱导肝癌细胞凋亡的检测将对数生长期的肝癌H22细胞进行离心，弃掉上清液，调整细胞密度至1×106/mL。6孔板中每孔加入2mL细胞悬液，放入37oC培养箱中恒温培养24h。分别向各孔中加入不同浓度(浓度分别为：20、40、60、80、100μg/mL)的30%乙醇洗脱部位、70%乙醇洗脱部位及95%乙醇洗脱部位，对照组加入等体积的生理盐水(含DMSO)，在培养箱中处理24h。分别吸取各组上清液于离心管中，将胰蛋白酶消化细胞转移至各离心管中，进行离心(800rpm/min、5min)，吸取上清液，用预冷的磷酸缓冲液(PBS)对细胞进行洗涤，洗涤2次。按照试剂盒操作步骤，加入AnnexinV-FITC和PI染液，充分混匀后，避光染色半小时。检测细胞的凋亡情况。4.4.4不同浓度乙醇洗脱部位诱导肝癌细胞凋亡的结果用各洗脱部位对肝癌H22细胞进行处理，测定其细胞凋亡率。由图3
湖北中医药大学2020届硕士学位论文12可知，70%乙醇洗脱部位诱导肝癌细胞凋亡的作用最强，30%乙醇洗脱部位及95%乙醇洗脱部位作用次之。且随着各乙醇洗脱部位浓度的增加，细胞的凋亡率也随之增高。此外，当浓度为20、40、60μg/mL，70%乙醇洗脱部位与其他洗脱部位相比较，诱导细胞凋亡作用表现出显著性差异(P＜0.05)。当浓度为80、100μg/mL，70%乙醇洗脱部位与其他洗脱部位相比，它诱导细胞凋亡作用具有非常显著的差异(P＜0.01)。图3大孔树脂柱各洗脱部位对肝癌H22细胞凋亡的作用4.4.5讨论本课题采用CCK-8法对细胞增殖进行测定，而没有选择传统的MTT法，这是因为CCK-8法具有灵敏度高、重复性强、操作方便、检测速度快、结果准确等一系列优点。CCK-8的原理是其中含有的WST-8被氧化还原，从而生成黄色的甲臜染料，其生成的甲臜染料数量与活细胞数量成正比。根据体外药理实验的结果可知，可以确认70%洗脱部位效果最佳。4.5不同浓度的乙醇洗脱部位体内抑制肝癌细胞实验4.5.1细胞株来源肝癌细胞株H22(鼠源性；腹水型肝癌细胞株),购自于武汉大学中国典型培养物保藏中心。4.5.2实验动物来源昆明小鼠(雌性，4-6周；体重20-22g)，购自于湖北省实验动物研究中心。4.5.3实验方法25只4-6周龄的小鼠右腿外侧接种H22细胞，2×105/只。7天后，将25只小鼠随机分成5组，为生理盐水组、水洗脱部位组、30%乙醇洗脱
【参考文献】：
期刊论文
[1]新型内质网应激诱导蛋白TRIM25在乳腺癌细胞中的作用研究[J]. 陶诗诗,陈亮. 集成技术. 2020(01)
[2]姜黄、莪术、郁金三药临床应用情况分析[J]. 杨月红,潘宇炯,周昕,李瑶,杨铭. 药学服务与研究. 2019(06)
[3]内质网应激在肝脏糖脂代谢及代谢性肝病中的作用[J]. 程涵博,吕颂雅,刘勇. 中国细胞生物学学报. 2019(11)
[4]鹿茸多肽对轻度认知功能障碍模型大鼠海马组织中AKT、PI3K、Caspase-9表达的影响[J]. 赵昕彤,徐岩,周佳,李鑫,杨明慧,刘玥欣,律广富,林贺,许佳明,黄晓巍. 中国医院药学杂志. 2019(22)
[5]PI3K/AKT信号通路调控心肌细胞凋亡的研究进展[J]. 李玉华,赵敏. 疑难病杂志. 2019(11)
[6]Protective effects of organic extracts of Alpinia oxyphylla against hydrogen peroxide-induced cvtotoxicitv in PC12 cells[J]. Li-Hong Duan,Meng Li,Chun-Bao Wang,Qing-Mei Wang,Quan-Quan Liu,Wan-Feng Shang,Ya-Jin Shen,Zhuo-Hua Lin,Tong-Yang Sun,Zheng-Zhi Wu,Ying-Hong Li,Yu-Long Wang,Xun Luo. Neural Regeneration Research. 2020(04)
[7]内质网应激的信号通路及其与细胞凋亡相关疾病关系的研究进展[J]. 叶勇,赵海霞,张长城. 山东医药. 2019(17)
[8]甾醇载体蛋白2抑制剂的研究进展[J]. 陶涛,杜馨. 植物保护. 2019(02)
[9]姜黄化学成分及药理作用研究进展[J]. 孙林林,乔利,田振华,赵盼,蒋海强,杨雯晴,李运伦. 山东中医药大学学报. 2019(02)
[10]基于抗Aβ1-42淀粉样蛋白活性的不同产地姜黄质量评价研究[J]. 曾瑾,李青苗,王晓宇,戴瑛,周丽娟,赵军宁. 中药药理与临床. 2019(01)
博士论文
[1]黄丽娟教授学术思想临床经验总结及治疗高脂血症的临床研究[D]. 尚菊菊.北京中医药大学 2016
[2]猪圆环病毒2型感染诱导PK-15细胞内质网应激与凋亡的机制研究[D]. 周莹珊.浙江大学 2016
[3]自噬在LPS诱导的肺泡上皮细胞死亡中的作用及机制研究[D]. 李少莹.第三军医大学 2015
[4]肺癌细胞株中miRNA的筛选及miR-544a促进肺癌细胞转移的机制研究[D]. 莫晓媚.中国海洋大学 2014
[5]绒山羊肌内脂肪沉积特征及脂肪细胞分化机理的研究[D]. 杜琛.内蒙古农业大学 2014
[6]莪术溃坚方对胰腺癌抑瘤作用及其机理研究[D]. 徐新生.天津医科大学 2014
[7]ATF4和miR-4458对肝癌细胞的抑制作用及初步分子机制研究[D]. 唐丹.第二军医大学 2014
[8]铜负荷大鼠肝星状细胞凋亡p38MAPK信号通路探讨及通腑利湿化瘀散结方对其干预的代谢组学研究[D]. 张娟.湖北中医药大学 2012
[9]益智的抗氧化作用及成分研究[D]. 刘红.华南理工大学 2006
硕士论文
[1]半夏当归赤小豆汤抗肿瘤作用及机制研究[D]. 张群.河南大学 2019
[2]广西莪术中抗鼻咽癌活性成分开发及应用[D]. 李旭梅.桂林医学院 2018
[3]保妇康栓联合抗HPV生物蛋白敷料治疗高危型HPV感染的临床疗效[D]. 廖晨晨.湖北中医药大学 2017
[4]SSAT通过AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭[D]. 阮平.河南大学 2016
[5]三七总皂苷的大孔树脂吸附特性[D]. 侯懿娜.云南中医学院 2016
[6]山柰化学成分的研究[D]. 吴华东.华中科技大学 2016
[7]姜黄次生代谢产物生理调控研究[D]. 杨晨.华侨大学 2014
[8]中药郁金 姜黄 莪术的化学成分比较研究[D]. 王颖.重庆大学 2014
[9]益智化学成分的研究[D]. 侯蕾.北京协和医学院 2013
[10]Caspase家族在恶性黑色素瘤血管生成拟态形成过程中作用的初步研究[D]. 赵建民.天津医科大学 2012
本文编号：3438622
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