NGAL噬菌体单链抗体的筛

发布时间：2017-05-07 07:11

  本文关键词：NGAL噬菌体单链抗体的筛选、表达及其在免疫胶体金检测方法中的初步应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程密切相关,是新的早期肾损伤生化标志物。本研究旨在应用噬菌体展示技术筛选NGAL特异性抗体,并建立免疫胶体金检测技术,为体内NGAL变化水平的检测提供方法,为急性肾损伤的诊断提供帮助。本论文采用免疫的Balb/C小鼠,从其脾脏中提取总RNA,以反转录的cDNA为模板,通过设计的简并引物来扩增轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),经过重叠延伸PCR方法连接为单链抗体基因(scFv)。经sfiI、Xbal双酶切后连接到噬菌体载体pCantab5E中,转化大肠杆菌TGl成功构建了库容为5×107pfu的鼠源噬菌体抗体库。经过PCR检测,抗体库的插入率为85%。随机挑取部分单克隆测序分析发现抗体重链和轻链可变区序列均不相同,说明了本研究构建的鼠源噬菌体抗体库多样性较好。以重组蛋白NGAL作为靶蛋白对噬菌体抗体库进行了四轮富集,从第四轮筛选后的抗性平板上挑取了30个单克隆进行了噬菌体抗体ELISA鉴定,将阳性克隆构建CHO细胞表达载体,转染到CHO细胞中并进行压力筛选、重组表达,对表达纯化后的抗体进行了SDS-PAGE、ELISA效价及亲和力分析。结果表明,单克隆有11个为强阳性。ELISA测定抗体效价为1:107,抗体亲和力为6.532×10-9M。表明本论文成功获得了NGAL基因工程抗体,为NGAL检测诊断方法的建立提供了物质基础。应用重组表达的抗体与实验室制备的多抗,建立了NGAL免疫胶体金检测方法。确定了免疫胶体金层析方法最优条件：金标抗体标记量12μg/mL,金标抗体的稳定剂为0.08%的PEG-20000,金标抗体的保存液为20 mM pH 8.2硼酸缓冲液(含0.01%Na2N3、0.08% PEG-20000);结合垫处理液为20 mM pH 9.0 Tris-HCl(含0.5% PVP-40、0.5% Trion)、样品垫处理液为0.01 mol/L pH 7.4 TBS(含1% BSA、0.05% Tween20)、金标抗体喷涂量为0.5μL/mL、羊抗NGAL抗体喷涂量为1.2μL/mL、羊抗人的IgG喷涂量为4μL/mL。将试纸条分别置于37℃及4℃密封干燥避光保存,到第20周其敏感性和特异性均没有降低。使用该试纸条对40份临床样本进行了检测,结果与临床检测结果完全一致。上述结果表明,本论文建立的免疫胶体金检测方法的稳定性、特异性较高,在临床样品检测上有较高的价值。
【关键词】：噬菌体抗体库 NGAL 筛选 真核表达 免疫胶体金
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.6
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 绪论10-21
• 1.1 NGAL简介10-12
• 1.2 基因工程抗体简介12-15
• 1.2.1 基因工作抗体的种类12-13
• 1.2.2 基因工程抗体的表达系统13-15
• 1.3 噬菌体抗体库技术及其应用的研究进展15-18
• 1.3.1 噬茵体抗体库技术的优点15
• 1.3.2 噬菌体抗体的分类15-16
• 1.3.3 目标抗体的筛选与表达16-17
• 1.3.4 噬菌体抗体库技术应用的研究进展17-18
• 1.4 免疫胶体金技术概述18-19
• 1.4.1 免疫胶体金技术的基本原理18-19
• 1.4.2 免疫胶体金技术的优点19
• 1.5 本研究的目的和意义19-21
• 第二章 NGAL噬菌体抗体库的构建21-31
• 2.1 引言21
• 2.2 试剂与仪器21-22
• 2.2.1 实验试剂及材料21-22
• 2.2.2 实验仪器22
• 2.3 试验方法22-26
• 2.3.1 BALB/c鼠免疫22
• 2.3.2 小鼠脾脏总RNA提取22
• 2.3.3 反转录合成cDNA22
• 2.3.4 PCR扩增小鼠抗体轻链、重链基因22-24
• 2.3.5 ScFv的PCR扩增24
• 2.3.6 ScFv基因与载体pCantab5E酶切24
• 2.3.7 抗体基因ScFv与载体pCantab5E连接24-25
• 2.3.8 连接产物电击转化25
• 2.3.9 噬菌体抗体库重组率鉴定和多样性分析25-26
• 2.4 试验结果26-29
• 2.4.1 NGAL蛋白免疫小鼠血清效价测定26
• 2.4.2 小鼠脾脏RNA提取26
• 2.4.3 小鼠抗体VH和VL PCR扩增26-27
• 2.4.4 ScFv基因PCR拼接27
• 2.4.5 NGAL小鼠噬菌体抗体库库容27-28
• 2.4.6 噬菌体抗体库的插入率及多样性分析28-29
• 2.5 本章小结29-31
• 第三章 NGAL噬菌体抗体库的筛选及抗体表达31-42
• 3.1 引言31
• 3.2 试剂与仪器31-32
• 3.2.1 实验试剂及材料31-32
• 3.2.2 实验仪器32
• 3.3 试验方法32-37
• 3.3.1 噬菌体表面展示抗体库的制备32
• 3.3.2 NGAL噬菌体抗体库的筛选32-33
• 3.3.3 ELISA鉴定重组噬菌体单克隆33
• 3.3.4 阳性克隆序列分析33
• 3.3.5 重组抗体真核表达载体构建33-34
• 3.3.6 表达质粒转化CHO细胞34
• 3.3.7 双抗夹心ELISA方法检测重组抗体的表达34-35
• 3.3.8 重组抗体的纯化35
• 3.3.9 纯化抗体的SDS-PAGE鉴定35-36
• 3.3.10 ELISA鉴定纯化后抗体活性36
• 3.3.11 亲和力测定36-37
• 3.4 试验结果37-40
• 3.4.1 NGAL噬菌体抗体库的富集37
• 3.4.2 噬菌体单克隆鉴定37-38
• 3.4.3 噬菌体抗体基因序列38
• 3.4.4 抗体基因表达载体构建38-39
• 3.4.5 ELISA鉴定细胞表达上清39
• 3.4.6 纯化抗体SDS-PAGE鉴定39
• 3.4.7 纯化抗体的活性鉴定39-40
• 3.4.8 纯化抗体的活性鉴定40
• 3.5 本章小结40-42
• 第四章 NGAL基因工程抗体在免疫胶体金检测方法中的应用42-52
• 4.1 引言42
• 4.2 试剂与仪器42-43
• 4.2.1 实验试剂及材料42
• 4.2.2 实验仪器42-43
• 4.3 试验方法43-46
• 4.3.1 金标抗体的制备与纯化43
• 4.3.2 结合垫、样品垫的预处理43
• 4.3.3 金垫的制备及抗体喷涂43
• 4.3.4 免疫胶体金测试条的组装43-44
• 4.3.5 免疫胶体金层析法各种最佳条件的选择44-46
• 4.3.6 测试方法与评判46
• 4.3.7 特异性试验46
• 4.3.8 稳定性试验46
• 4.3.9 对临床样品的检测46
• 4.4 试验结果46-50
• 4.4.1 免疫胶体金层析法各种最佳条件的选择46-49
• 4.4.2 特异性试验49
• 4.4.3 稳定性试验49-50
• 4.4.4 对临床样品的检测50
• 4.5 本章小结50-52
• 第五章 总结和展望52-53
• 5.1 总结52
• 5.2 展望52-53
• 参考文献53-60
• 硕士期间发表论文60-61
• 致谢61

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  本文关键词：NGAL噬菌体单链抗体的筛选、表达及其在免疫胶体金检测方法中的初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：349427