利用全外显子测序筛选人类小头畸形致病基因

发布时间：2022-01-13 17:01

　　小头畸形（Microcephaly,MCPH）是一种基于常染色体隐性遗传模式的神经发育障碍,多见于近亲婚配的后代中。与正常人相比,患者大脑结构正常但头颅整体较小,患者出生时枕额头围（Occipitofrontal head circumference,OFC）比正常人低2-3个标准差（Standard deviations,SDs）,大脑体积和大脑皮层的表面积明显较小。患者有一定程度的智力障碍,一些患者还会出现多动症、表达性语言障碍和癫痫等症状。小头畸形的致病因素包括遗传和环境因素,目前已报道的与小头畸形相关的基因有18个,随着新一代测序技术的不断发展,更多的相关基因和变异将会被发现。本课题利用全外显子测序技术,检测了2个巴基斯坦患者家系的DNA样本,筛选到ASPM（c.77delG,p.G26fs）和NDE1（c.728delC,p.T243fs）新的致病变异,经过Sanger测序验证了突变位点的正确性。此外,我们对ASPM和NDE1的突变蛋白进行了结构预测,发现ASPM突变导致移码突变产生截断蛋白,NDE1突变导致移码突变使蛋白序列发生改变。ASPM和NDE1的突变改变蛋白质结构和... 

【文章来源】：华侨大学福建省

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【学位级别】：硕士

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部分小头畸形患者照片

3图1.1：部分小头畸形患者照片图1.2大脑核磁共振成像（MRI）图。（A）正常大脑横断面MRI；（B）小头畸形患者大脑横断面核磁共振成像，白色箭头指出的地方显示脑回简化程度不一，额叶较小；（C）小头畸形患者大脑矢状面MRI，黑色箭头指出的地方显示胼胝体发育不全；（D）小头畸形患者大脑矢状面MRI，黑色箭头指出的地方显示小脑蚓部轻度发育不全，白色箭头指出的地方显示脑桥相对较校1.1.2小头畸形的致病基因及致病机理到目前为止，已经有18个与小头畸形相关的基因被报道，分别是MCPH1--MCPH18，MCPH基因在物种间高度保守，在脑进化过程中发挥作用[10]。这些基因编码的蛋白与多种细胞过程有关，如着丝粒完整性、染色质重塑、中心粒生物发生、中心体成熟等，这些基因突变产生的异常蛋白会导致细胞周期调控失衡和异常的有丝分裂，从而导致小头畸形的发生。MCPH1（Microcephalin）基因位于染色体8p23上，包含14个外显子，共编码835个氨基酸，该基因参与决定了大脑体积的大小，在灵长类谱系中是高度保守的[11]。MCPH1蛋白是端粒完整性的重要调控因子，在神经祖细胞的分裂和衰老中起重要调节作用，同时还参与DNA损伤修复、肿瘤抑制等[12]。研究认

11全外显子测序（WES）是利用探针杂交捕获外显子区域的DNA序列，经富集后通过高通量测序的技术，主要用于识别和研究与疾并种群进化相关的编码区及调控区域（Untranslatedregions,UTR）相关的遗传突变。外显子区域DNA序列的捕获是该技术的重点，常用的方法有固相捕获法和液相捕获法[74]。固相捕获法是利用探针，通过碱基互补配对来捕获目标序列，其中“探针”一般为微阵列或过滤器，附着在固相载体上[75]。当基因组DNA被消化成短片段后与探针杂交，目标片段被捕获而非靶向片段被冲走，之后目标片段在固相载体上被富集，最后洗脱测序（图1.3A）。该方法可以有效地捕获大规模的外显子组，但是该方法有一些缺点：如需要提供较多的DNA信息，同时所需的硬件较昂贵[76]。随着技术的不断发展，液相捕获技术应运而生，该方法与固相捕获法类似，不同点在于探针不再固定在固相载体上，而是与生物素结合。该方法首先用生物素标记探针，之后将生物素标记的探针与消化后的DNA片段杂交，之后加入磁性链霉素株与生物素标记的探针结合，同样的目标DNA片段与探针结合，非靶向片段被冲洗掉，之后将目标片段从探针中洗脱出来进行测序（图1.4B）[77]。与固相捕获法相比，该方法所需的DNA量更少，试剂成本较低，具有更好的灵活性，因此，液相捕获法被广泛的应用。图1.3外显子捕获技术原理图。（A）固相捕获技术，（B）液相捕获技术。目前，常用的液相法外显子捕获试剂盒有3种，分别是：Agilent公司的SureSelect试剂盒、Roche公司的NimbleGen试剂盒和Illumina公司的Nextera


本文编号：3586815