microRNA-140-5p对脓毒症树突状细胞表型及功能的影响

发布时间：2022-02-13 21:41

　　目的:探究microRNA-140-5p（miR-140-5p）对脓毒症树突状细胞（Dendritic cell,DC）表型及功能的影响。方法:⑴取人外周血提取单核细胞,以人重组细胞因子白介素4（IL-4）及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导分化体外培养单核细胞来源树突状细胞（monocyte-derived dendritic cells,MoDC）。⑵实验分组及细胞处理方法:对照组:在MoDC体外诱导培养的第五天加入1ug/ml的LPS培养48小时;脓毒症模型组:培养全过程以1ug/ml的LPS给与持续刺激;脓毒症+转染处理组:同脓毒症模型组处理,在培养的第5天转染（miR-140-5p mimics、inhibitor及相应的对照miR-NC）培养12小时后再加1ug/ml浓度的LPS处理48小时。⑶细胞流式检测不同处理组树突状细胞表面共刺激分子（CD80、CD86及HLA-DR）的表达及细胞凋亡情况⑷荧光显微镜检测细胞转染后的胞内荧光信号;荧光定量PCR（q-PCR）检测不同处理组DC miR-140-5P表达情况。⑸酶标仪检测不同处理组DC促T细胞增殖作用的变化... 

【文章来源】：南昌大学江西省211工程院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

的演示方法，取2支SepMate-50RUO离心管，向管中加15mlLymphoprep单个核细胞梯度离心液，水平旋子离心机1000转离心1分钟取出图1-1.SEPMATE梯度离心的演示图例

一、LPS刺激对树突状细胞表面共刺激分子表达、凋亡及胞内miR-140-5p表达的影响10表1-4.U6qPCRReactionReagentVolume(μl)ddH2O9TBGreenAdvantagePremix(2X)12.5ROXDye(50X)0.5U6ForwardPrimer(10μM)0.5U6ReversePrimer(10μM)0.5cDNA2Totalvolume25⑶核酸电泳：30mlTAE缓冲液溶解0.3g琼脂糖，微波炉加热2分钟以溶解完全。待胶液稍冷却后加入3ulGel-Red显色剂混匀，缓慢倒入准备好的制胶槽位（10孔梳子）内，30分钟胶可凝固；把胶准确放入电泳槽中（样品孔位于负极），加TAE缓冲液作为电泳缓存液，将miRNA反转扩增的产物与上样缓冲液（6×）按比例混匀，加入样品槽中。接通电源后，调节电压100V电泳，直至样本蓝色指示带接近胶边缘停止电泳。将胶取出后，于凝胶成像系统中观察凝胶中发荧光的目的条带并拍照记录。1.1.4统计学处理以GraphPad8.0软件处理数据，所有的数据均以平均值±标准差表示，采用两独立样本t检验比较计量资料，以P值＜0.05为差异具有统计学意义。1.2实验结果1.2.1人外周血单核细胞来源树突状细胞培养经磁珠分选得到外周血单核细胞，流式检测鉴定CD14+单核细胞纯度在95%以上，符合细胞实验要求，见图1-2（A、B、C）；树突状细胞培养过程中，第5天收获iDC流式检测鉴定其细胞纯度，光镜下观察细胞形态见图1-3。图1-2流式检测CD14+细胞纯度图注:A：流式圈定单个核细胞；B：CD45+细胞；C：CD45+/CD14+细胞；D：CCR5+细胞

一、LPS刺激对树突状细胞表面共刺激分子表达、凋亡及胞内miR-140-5p表达的影响111.2.2脓毒症DCmiR-140-5P表达明显降低对提取的总RNA加尾反转后，进一步扩增miRNA反转得到的DNA片段，核酸电泳显示在100bp之下可见miR-140-5P的目的条带，q-PCR的进一步检测对照组及体外脓毒症模型两组间的miR-140-5P的表达情况发现：与对照组相比，体外脓毒症模型miR-140-5P表达明显降低（p＜0.01）。每次q-PCR实验均保证溶解曲线峰的单一性以排除非特异性扩增产物的干扰。见图1-4，图1-5。图1-3树突状细胞培养过程中的光镜下观察图片图1-4A:miR-140-5P扩增产物核酸电泳图B：对照组(NC)及脓毒症组(LPS+)DCmiR-140-5P的表达**表示与对照组相比，脓毒症组（LPS刺激组）miR-140-5P表达有显著差异（p＜0.01）

【参考文献】：
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