CGA衍生抗菌多肽bCAT抗白念珠菌生物被膜的增效作用研究
发布时间：2022-02-14 10:42
目的:探讨嗜铬粒蛋白A（chromogranin,CGA）衍生多肽bCAT联合卡泊芬净（caspofungin,CAS）及载bCAT纳米粒子（bCAT-NPs）联合超声对白色念珠菌生物被膜作用及可能机制。方法:以标准菌株ATCC10231为研究对象,XTT法检测bCAT联合CAS及bCAT-NPs联合超声作用后生物被膜代谢活性的变化,并计算抗生物被膜50%的MIC(MBIC50),倒置显微镜观察生物被膜形态变化,RT-PCR检测黏附因子ALS3的mRNA表达,激光共聚焦（confocal laser scanning microscopy,CLSM）观察生物被膜通透性的变化。统计学方法采用单因素方差分析,采用Dunnett T3检验进行组内两两比较。结果:bCAT及CAS抗生物被膜的MBIC50分别为1280μmol/L、128μg/mL,两者联合使用时抗被膜的MBIC50分别降至320μmol/L、4μg/mL,RT-PCR发现bCAT+CAS组处理被膜后ALS3表达量为1.71±0.65%,与control、bCAT...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
XTT法检测被膜代谢活性Figure1.ThemetabolicactivityofbiofilmwasdetectedbyXTTassay
重庆医科大学硕士研究生学位论文16(2)白色念珠菌冻干粉恢复培养：用无菌吸管吸取500μlYPD液体培养基，加入至安瓿管内，振荡，使冻干粉完全溶解呈悬浮状。吸取全部菌体悬浮液，移植于2个麦芽汁琼脂平板上，置于37℃孵箱培养24~48h。(3)菌株传代：麦芽汁琼脂培养基上观察到单个菌落生成，酒精灯烧灼接种环后，刮取适量菌落以划线法涂抹于SDA平板上，37℃浮箱培养24~48h。(4)SDA平板观察单个菌落生成，挑取单个菌落置于装有2mlYPD液体培养基的离心管中，100rpm，37℃培养24h。(5)冻存菌种：摇匀YPD培养基中的白色念珠菌悬液，使用微量移液枪吸取600μl的菌液置于1.5ml冻存管中，再加入400μl石蜡油作为冻存保护液（石蜡油与菌液按4:6比例）。标记冻存菌株编号及日期，将冻存管置于-80℃保存。(6)生物被膜培养：-80℃取出冻存菌液，迅速溶解，使用烧灼后的接种环沾取适量菌液通过划线法接种于SDA平板上，置于37.0℃孵箱培养24h以形成单个菌落。挑选单个菌落接种于YPD培养基中37.0℃、100rpm培养24h，随后使用RPMI-1640培养基调整菌液浓度为106cells/ml。96孔板中加入100μl菌液，另加入100μlRPMI-1640培养基作为阴性对照（每个实验组重复三个复孔），包裹保鲜膜后37℃培养24h，PBS清洗底部未黏附真菌细胞，通过XTT法检测生物被膜形成能力，判断标准为[22]：OD≤ODc，无生物被膜形成能力；ODc＜OD≤2ODc，较弱生物被膜形成能力；2ODc＜OD≤4ODc，中等生物被膜形成能力；OD＞4ODc，强生物被膜形成能力。其中ODc表示空白组OD值，OD为实验组OD值。图2.SDA平板培养白色念珠菌Figure2.C.albicanswereculturedwithSDAplate
重庆医科大学硕士研究生学位论文19标准，与control组相比有强形成生物被膜能力。表2.菌株ATCC10231生物被膜的形成能力Table2.TheabilityofATCC10231toformbiofilmOD490nm形成被膜能力ATCC102310.76±0.05强空白对照组0.08±0.01-判断标准：OD≤ODc，无生物被膜形成能力；ODc＜OD≤2ODc，较弱生物被膜形成能力；2ODc＜OD≤4ODc，中等生物被膜形成能力；OD＞4ODc，强生物被膜形成能力。其中ODc表示空白组OD值，OD为实验组OD值。4.2bCAT及CAS抗生物被膜能力经XTT发现，bCAT及CAS抗生物被膜MBIC50分别为1280μmol/L、128μg/mL。bCAT浓度为1280μmol/L时，生物被膜代谢活性为44.25±5.26%，不同bCAT浓度比较差异具有统计学意义（F=55.71，P＜0.05），两两比较发现各组与1280μmol/L组相比，差异具有统计学意义，P＜0.05（图3A）。不同浓度CAS作用后生物被膜活性改变如图3B所示，当CAS浓度为128μg/mL时，被膜代谢活性为41.99±11.88%，组间比较差异具有统计学意义（F=44.43，P＜0.05），两两比较发现各组与128μg/mL组相比，差异具有统计学意义，P＜0.05。图3.bCAT及CAS抑制白色念珠菌生物被膜的作用。图3A，bCAT对白色念珠菌生物被膜代谢活性的影响。图3B，CAS对白色念珠菌生物被膜代谢活性的影响。*表示与bCAT浓度为1280μmol/L及CAS浓度为128μg/mL比，P＜0.05，差异具有统计学意义。
【参考文献】：
期刊论文
[1]多肽bCAT通过下调白念珠菌HWP1基因表达抑制生物被膜的形成机制[J]. 许珊,张舒,张丹,刘思佚,刘梳柯. 中国感染与化疗杂志. 2017(04)
[2]CHR抑制白假丝酵母菌生物被膜形成作用及机制探讨[J]. 张舒,许珊,张丹,黄文祥,魏伏,刘思佚,罗盛淑,何琴,李佳俊. 重庆医科大学学报. 2016(10)
本文编号：3624401
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
XTT法检测被膜代谢活性Figure1.ThemetabolicactivityofbiofilmwasdetectedbyXTTassay
重庆医科大学硕士研究生学位论文16(2)白色念珠菌冻干粉恢复培养：用无菌吸管吸取500μlYPD液体培养基，加入至安瓿管内，振荡，使冻干粉完全溶解呈悬浮状。吸取全部菌体悬浮液，移植于2个麦芽汁琼脂平板上，置于37℃孵箱培养24~48h。(3)菌株传代：麦芽汁琼脂培养基上观察到单个菌落生成，酒精灯烧灼接种环后，刮取适量菌落以划线法涂抹于SDA平板上，37℃浮箱培养24~48h。(4)SDA平板观察单个菌落生成，挑取单个菌落置于装有2mlYPD液体培养基的离心管中，100rpm，37℃培养24h。(5)冻存菌种：摇匀YPD培养基中的白色念珠菌悬液，使用微量移液枪吸取600μl的菌液置于1.5ml冻存管中，再加入400μl石蜡油作为冻存保护液（石蜡油与菌液按4:6比例）。标记冻存菌株编号及日期，将冻存管置于-80℃保存。(6)生物被膜培养：-80℃取出冻存菌液，迅速溶解，使用烧灼后的接种环沾取适量菌液通过划线法接种于SDA平板上，置于37.0℃孵箱培养24h以形成单个菌落。挑选单个菌落接种于YPD培养基中37.0℃、100rpm培养24h，随后使用RPMI-1640培养基调整菌液浓度为106cells/ml。96孔板中加入100μl菌液，另加入100μlRPMI-1640培养基作为阴性对照（每个实验组重复三个复孔），包裹保鲜膜后37℃培养24h，PBS清洗底部未黏附真菌细胞，通过XTT法检测生物被膜形成能力，判断标准为[22]：OD≤ODc，无生物被膜形成能力；ODc＜OD≤2ODc，较弱生物被膜形成能力；2ODc＜OD≤4ODc，中等生物被膜形成能力；OD＞4ODc，强生物被膜形成能力。其中ODc表示空白组OD值，OD为实验组OD值。图2.SDA平板培养白色念珠菌Figure2.C.albicanswereculturedwithSDAplate
重庆医科大学硕士研究生学位论文19标准，与control组相比有强形成生物被膜能力。表2.菌株ATCC10231生物被膜的形成能力Table2.TheabilityofATCC10231toformbiofilmOD490nm形成被膜能力ATCC102310.76±0.05强空白对照组0.08±0.01-判断标准：OD≤ODc，无生物被膜形成能力；ODc＜OD≤2ODc，较弱生物被膜形成能力；2ODc＜OD≤4ODc，中等生物被膜形成能力；OD＞4ODc，强生物被膜形成能力。其中ODc表示空白组OD值，OD为实验组OD值。4.2bCAT及CAS抗生物被膜能力经XTT发现，bCAT及CAS抗生物被膜MBIC50分别为1280μmol/L、128μg/mL。bCAT浓度为1280μmol/L时，生物被膜代谢活性为44.25±5.26%，不同bCAT浓度比较差异具有统计学意义（F=55.71，P＜0.05），两两比较发现各组与1280μmol/L组相比，差异具有统计学意义，P＜0.05（图3A）。不同浓度CAS作用后生物被膜活性改变如图3B所示，当CAS浓度为128μg/mL时，被膜代谢活性为41.99±11.88%，组间比较差异具有统计学意义（F=44.43，P＜0.05），两两比较发现各组与128μg/mL组相比，差异具有统计学意义，P＜0.05。图3.bCAT及CAS抑制白色念珠菌生物被膜的作用。图3A，bCAT对白色念珠菌生物被膜代谢活性的影响。图3B，CAS对白色念珠菌生物被膜代谢活性的影响。*表示与bCAT浓度为1280μmol/L及CAS浓度为128μg/mL比，P＜0.05，差异具有统计学意义。
【参考文献】：
期刊论文
[1]多肽bCAT通过下调白念珠菌HWP1基因表达抑制生物被膜的形成机制[J]. 许珊,张舒,张丹,刘思佚,刘梳柯. 中国感染与化疗杂志. 2017(04)
[2]CHR抑制白假丝酵母菌生物被膜形成作用及机制探讨[J]. 张舒,许珊,张丹,黄文祥,魏伏,刘思佚,罗盛淑,何琴,李佳俊. 重庆医科大学学报. 2016(10)
本文编号：3624401
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