利用AkaLumine/Akaluc系统对移植神经细胞活体示踪

发布时间：2023-03-05 02:49

　　由于中枢神经系统的疾病复杂,神经元处于终末分化期不具有分裂再生能力,而成体神经干细胞数量非常有限,因此神经系统损伤后的自我恢复能力差。对于神经系统疾病的治疗寄希望于外源细胞的移植替代修复。已有研究表明移植神经干细胞具有修复损伤,消除损伤灶周围炎症以及重塑神经网络阻止内源神经元退行性病变的作用。人多能干细胞具有自我更新和高效分化为神经细胞的能力,为移植用神经细胞的理想来源。因此,人多能干细胞体外分化来源的神经干细胞对于神经系统疾病治疗具有重要的临床应用前景。但是大量研究表明神经干细胞移植体内后需经历很长一段时间的分化成熟过程,在此过程中对细胞在体内的存活,迁移等状态进行活体追踪成为亟需解决的问题。目前活体成像追踪技术主要有荧光成像及生物发光成像,但由于脑组织较厚,且血液和淋巴组织具有吸收光的特性,严重阻碍荧光或自发光的观察。现有的活体示踪技术并不能满足目前科学研究的需求,因此需要构建一套更为精准的示踪系统。Aka Lumine/Akaluc系统是根据生物发光成像Luciferin/Luciferase(荧光素酶)检测系统改造,将luciferin底物的结构进行改变,并根据底物的构象对lu...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
前言与文献回顾
第一章 引言
    1.1 神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病
        1.1.1 移植神经干细胞在体内的作用
        1.1.2 神经干细胞移植的研究前景
    1.2 体内示踪技术及其在神经干细胞移植中的应用
        1.2.1 同位素成像
        1.2.2 生物荧光成像
        1.2.3 生物发光成像
        1.2.4 生物发光成像的研究进展
        1.2.5 生物发光成像应用于神经细胞移植后的体内追踪
    1.3 活体示踪中的基因编辑技术
        1.3.1 RNA引导的CRISPR-cas9 核酸酶技术
        1.3.2 CRISPR-cas9 核酸酶技术的研究进展
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验细胞
        2.1.2 实验试剂盒
        2.1.3 实验试剂与耗材
        2.1.4 打靶基因
        2.1.5 实验仪器和设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 AAVS1定点敲入sg RNA的设计及其质粒构建
        2.2.2 sgRNA脱靶位点的验证
        2.2.3 sgRNA切割效率的验证
        2.2.4 同源重组载体的设计及相关质粒的构建
        2.2.5 人胚胎干细胞H1的复苏与培养
        2.2.6 同源重组载体及质粒PX330-sg RNA电转细胞
        2.2.7 基因组的提取及PCR鉴定
        2.2.8 细胞核型检测
        2.2.9 实时荧光定量PCR(q RT-PCR)鉴定多能性基因的表达
        2.2.10 流式细胞术检测多能性基因的表达
        2.2.11 畸胎瘤实验
        2.2.12 神经干细胞的诱导
        2.2.13 通过酶标仪检测生物发光
        2.2.14 通过活体成像仪检测生物发光
        2.2.15 293T细胞的复苏及培养
        2.2.16 质粒的瞬转
第三章 实验结果与分析
    3.1 实验结果
        3.1.1 验证CRISPR/Cas9 的切割效率及脱靶位点
        3.1.2 构建基因定点敲入AAVS1位点的同源重组打靶载体
        3.1.3 成功构建AKaluc基因敲入的胚胎干细胞系
        3.1.4 H1-AAVS1-EF1α-AKaluc-KI可以正常诱导分化形成神经干细胞
        3.1.5 体外鉴定H1-AAVS1-EF1α-AKaluc-KI细胞系的示踪能力
        3.1.6 体内鉴定H1-AAVS1-EF1α-AKaluc-KI细胞系的示踪能力
        3.1.7 启动子对AKaluc表达的影响
    3.2 讨论
    3.3 小结
结论
参考文献
综述
    参考文献
个人简介
致谢



本文编号：3755545