磁靶向基因转染复合物的构建及应用研究

发布时间：2017-05-19 18:23

  本文关键词：磁靶向基因转染复合物的构建及应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前,传统疾病治疗存在很大的局限性,随着基因信息技术的发展,研究人员对很多疾病的机制有了更深入的了解,由此提出了一种新的疾病治疗方法-基因治疗。近年来,基因治疗已被广泛应用于治疗遗传性疾病。非病毒载体具有制备简单、无免疫原性、基因装载量高等特点,在基因治疗中有广泛的应用,尤其是阳离子聚合物非病毒载体聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI),具有较高的转染效率,是公认的非病毒载体基因转染的金标准。随着纳米材料发展,磁性纳米材料因具有良好的磁学性能受到研究人员的广泛关注。其中,磁性四氧化三铁(Fe304)纳米颗粒以其良好的化学稳定性和优异的磁响应性在疾病的诊断和治疗方面具有重要的应用价值。本论文主要内容是以磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)和PEI为研究切入点,建立基于PEI的磁靶向基因转染系统,并初步探讨了将其应用于治疗心血管疾病的可能性。具体内容包括：1. Fe3O4@PAA纳米颗粒的制备利用高温分解法,分解乙酰丙酮铁,制备出Fe304纳米颗粒,并在其表面修饰上聚丙烯酸(polyacrylic acid, PAA)。利用透射电镜、傅立叶变换红外光谱及粒径电位分析等对所制备的颗粒进行了系统的表征研究。结果显示,PAA成功修饰到Fe304纳米颗粒上,所制备出的Fe3O4@PAA磁性纳米颗粒粒径均一,约为7-10nm,表面具有可观的负电荷,分散性良好,具有超顺磁性。2. PEI/DNA转染复合物的构建及转染性能评价利用细胞毒性分析、凝胶阻滞分析、粒径电位分析等方法,探讨了PEI作为基因载体的可行性并优化了转染条件。结果显示,PEI在低浓度时细胞毒性较低,可用于细胞实验,且具有很强的DNA结合浓缩能力,在较低的N/P值条件下就能与DNA形成稳定的复合物。复合物粒径较小,在145-160nm之间,表面具有可观的正电荷。在无血清条件下,PEI/DNA复合物在N/P=10时转染效率达到最高(94.9%)。3.基于PEI的磁靶向基因转染复合物的构建及转染性能评价MNPs、PEI和DNA通过静电自组装的方式形成转染复合物,通过细胞毒性分析、凝胶阻滞分析、粒径电位分析等方法,考察了MNPs/PEI的载体性能,并对其实验条件进行了优化。结果显示,MNPs/PEI在低浓度时细胞毒性较低,比PEI毒性稍高,但处于可接受范围内,可用于细胞实验。MNPs/PEI结合DNA的能力较PEI稍有减弱,但仍具有可观的DNA结合能力,可用作基因载体。MNPs/PEI/DNA复合物具有较小的粒径,在174-196nm之间,表面具有可观的正电荷。在磁场中可以增强转染效率。在PEI/DNA (N/P)=10、MNPs/DNA (v/w)=0.25、无血清、加磁场20min的条件下,转染效率达到最高。4.磁靶向敲除PCSK9基因研究枯草溶菌素转化酶9 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9, PCSK9)基因通过介导低密度脂蛋白受体(Low Density Lipoprotein Receptor, LDLR)降解,调节血浆低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol, LDL-C)水平,与心血管疾病的发生发展密切相关。本论文将优化后的磁靶向基因转染系统和CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) systems)基因敲除技术相结合,通过设计具有靶序列特异性的gRNA (guide RNA)序列引导,考察是否能成功地对PCSK9基因进行定点敲除。结果表明,在已有实验中尚未得到理想的结果,其原因可能是CRISPR/Cas9基因敲除系统具有相对较高的脱靶效应和单个切口的双链断裂激发的细胞自我修复导致基因敲除概率较低。后续尚需进行深入研究。
【关键词】：基因治疗 磁性纳米颗粒 聚乙烯亚胺 磁靶向基因转染 基因敲除
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R450
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 绪论11-33
• 1.1 前言11
• 1.2 磁性纳米颗粒的制备及其生物医学应用11-14
• 1.2.1 磁性纳米颗粒的制备方法12
• 1.2.2 磁性纳米粒子的生物医学应用12-14
• 1.3 基因治疗及其载体研究概况14-18
• 1.3.1 基因治疗概述14
• 1.3.2 基因治疗常用方法14-15
• 1.3.3 基因转染过程及障碍15-16
• 1.3.4 基因转染载体研究现状16-18
• 1.4 基于PEI的磁靶向基因转染技术研究概述18-20
• 1.4.1 PEI转染机制18
• 1.4.2 基于PEI的磁靶向基因转染18-20
• 1.5 基因敲除技术研究进展20-22
• 1.5.1 TALENs敲除机制20-21
• 1.5.2 CRISPR/Cas9敲除机制21-22
• 1.6 本研究的目的和意义22-23
• 参考文献23-33
• 第二章 单分散磁性Fe_3O_4@PAA纳米颗粒的制备33-41
• 2.1 前言33
• 2.2 实验材料与方法33-35
• 2.2.1 实验试剂与仪器33-34
• 2.2.2 实验方法34-35
• 2.3 实验结果与讨论35-38
• 2.3.1 Fe_3O_4与Fe_3O_4@PAA的制备35
• 2.3.2 磁性纳米颗粒的FT-IR光谱图35-36
• 2.3.3 磁性纳米颗粒的粒径和电位分析36-37
• 2.3.4 磁性纳米颗粒的磁滞回归曲线37-38
• 2.4 本章小结38-39
• 参考文献39-41
• 第三章 PEI/DNA转染复合物的构建及转染性能评价41-51
• 3.1 前言41
• 3.2 实验材料与方法41-44
• 3.2.1 实验试剂与仪器41-42
• 3.2.2 实验方法42-44
• 3.3 实验结果与讨论44-48
• 3.3.1 载体PEI的细胞毒性44-45
• 3.3.2 琼脂糖凝胶电泳阻滞实验45
• 3.3.3 PEI/pDNA转染复合物的粒径和Zeta电位检测45-46
• 3.3.4 不同N/P值对转染效率的影响46-47
• 3.3.5 血清对转染效率的影响47-48
• 3.4 本章小结48-49
• 参考文献49-51
• 第四章 基于PEI的磁靶向基因转染复合物的构建及转染性能评价51-65
• 4.1 前言51-52
• 4.2 实验材料与方法52-54
• 4.2.1 实验试剂与仪器52
• 4.2.2 实验方法52-54
• 4.3 实验结果与讨论54-61
• 4.3.1 磁靶向基因转染载体的细胞毒性54-55
• 4.3.2 琼脂糖凝胶电泳阻滞实验55
• 4.3.3 MNPs/PEI/pDNA转染复合物的粒径和Zeta电位检测55-56
• 4.3.4 不同v/w值对转染效率的影响56-57
• 4.3.5 不同N/P值对转染效率的影响57-58
• 4.3.6 血清对转染效率的影响58-59
• 4.3.7 加磁场时间对转染效率的影响59-60
• 4.3.8 不同细胞的转染效率60-61
• 4.3.9 普鲁士蓝染色61
• 4.4 本章小结61-62
• 参考文献62-65
• 第五章 磁靶向敲除PCSK9基因研究65-73
• 5.1 前言65
• 5.2 实验材料与方法65-69
• 5.2.1 实验试剂与仪器65-66
• 5.2.2 实验方法66-69
• 5.3 实验结果与讨论69-70
• 5.3.1 人PCSK9基因CRISPR/Cas9质粒设计与构建69-70
• 5.3.2 基因敲除分析70
• 5.4 本章小结70-71
• 参考文献71-73
• 第六章 总结与展望73-75
• 6.1 总结73-74
• 6.2 展望74-75
• 攻读硕士学位期间发表的论文75-77
• 致谢77

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